第二章第二章 DNA DNA与与RNARNA的制备的制备 第一节第一节 DNA DNA的制备的制备 DNADNA是生物的主要遗传物质，因而是生物的主要遗传物质，因而DNADNA的制的制备是基因工程的基础由于生物形式的多样性备是基因工程的基础由于生物形式的多样性（细菌、植物、动物），以及（细菌、植物、动物），以及DNADNA在生物体中存在生物体中存在形式的差异（染色体、线性在形式的差异（染色体、线性DNADNA、质粒），因、质粒），因此，制备此，制备DNADNA的过程和方法也不相同的过程和方法也不相同 一、一、DNADNA在生物体中的存在形式在生物体中的存在形式1 1．染色体．染色体DNADNA：生物体遗传信息：生物体遗传信息的主要载体的主要载体 * * 原核生物染色体：结构简单，储原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少存的信息相对较少 * * 真核生物染色体：结构复杂，储真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息存大量的遗传信息 用途：分离目的基因，研究基因用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达的调控与表达 2 2．病毒和噬菌体．病毒和噬菌体DNA DNA 构建克隆载体，分离目的基因构建克隆载体，分离目的基因 3 3．质粒．质粒(Plasmid)DNA(Plasmid)DNA（染色体外遗传物质）（染色体外遗传物质） 特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形 式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在。
式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在 用途：构建克隆载体，分离目的基因用途：构建克隆载体，分离目的基因 4 4．叶绿体和线粒体．叶绿体和线粒体DNADNA 构建克隆载体，分离目的基因构建克隆载体，分离目的基因 二、天然二、天然DNADNA的提取的提取1.1.准备生物材料：准备生物材料： 选取的材料选取的材料－－提取－－提取DNADNA得率最高的生长期，或是得率最高的生长期，或是DNADNA容容易提取或含量高的组织易提取或含量高的组织 细菌－－对数生长期后期细菌－－对数生长期后期 植物－－幼嫩组织、暗培养植物－－幼嫩组织、暗培养1 1－－2 2天天 肝脏－－清除胆囊（含高活性的酶）肝脏－－清除胆囊（含高活性的酶）2.2.裂解细胞裂解细胞: 原核生物－－溶菌酶，原核生物－－溶菌酶，NaOH/SDSNaOH/SDS，煮沸，冰冻，超声波，煮沸，冰冻，超声波 动、植物动、植物 －－粉碎－－粉碎 3.3.分离和抽提分离和抽提DNADNA: 1 1）提取总）提取总DNADNA 加蛋白质变性剂加蛋白质变性剂 2 2）提取叶绿体或线粒体等细胞器的）提取叶绿体或线粒体等细胞器的DNADNA、病毒和噬菌体、病毒和噬菌体DNADNA：： 先需要分离出完整的细胞器、病毒和噬菌体，提取先需要分离出完整的细胞器、病毒和噬菌体，提取DNADNA之前还需之前还需DNaseDNase处理，水解其它的处理，水解其它的DNADNA 3）） 提取质粒提取质粒DNA：使其与染色体：使其与染色体DNA分开分开 调节细胞裂解液的调节细胞裂解液的pH值达到值达到12.6再调节再调节pH值至中性值至中性所有所有DNA变性沉淀变性沉淀质粒质粒DNA复性后从沉淀中释放出复性后从沉淀中释放出 ( (一一) )、细菌总、细菌总DNADNA的制备的制备( (Escherichia coli)1.1.菌体培养菌体培养: : 将活化的菌体接种于将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani)LB(Luria- Bertani) 培养基，于培养基，于3737ºC C培养至对数生长期培养至对数生长期, ,然后置冰水浴然后置冰水浴20min20min2.2.收集菌体收集菌体: : 离心离心(5000g, 5 min) (50ml)(5000g, 5 min) (50ml)3.3.菌体裂解菌体裂解: : 加加5ml5ml冷冷 TES (0.1M Tris-HCl TES (0.1M Tris-HCl，，0.1M 0.1M EDTA EDTA，，0.15M NaCl,pH8.0)0.15M NaCl,pH8.0)加加10 mg 10 mg 溶菌酶溶菌酶, ,于于3737ºC C温温 育育10min10min 4. 去去RNA: 加入加入1 mg RNase于于50ºC温育温育15 min5. 去蛋白去蛋白: 加入加入0.6 ml、、10% SDS和和Protease K(0.1 mg/ml)，，60 ºC、、30min；加苯酚；加苯酚-氯仿抽提氯仿抽提(等体积等体积)6. 沉淀沉淀DNA: 加入加入1/10 V 的的NaAc，，2 V 无水乙醇；以玻璃无水乙醇；以玻璃 棒缠绕絮状沉淀，溶于棒缠绕絮状沉淀，溶于TE Buffer中中 ( (二二) )、细菌质粒、细菌质粒DNADNA的制备的制备常用的常用的碱法碱法、、煮沸法煮沸法、、SDS等均可；等均可； 选择何种方法制备质粒选择何种方法制备质粒DNA，视不同的菌株和不同，视不同的菌株和不同大小的质粒大小的质粒DNA分子以及以后进行的不同实验等具体情分子以及以后进行的不同实验等具体情况而定：况而定： 菌株类型：如大量提取菌株类型：如大量提取HB101、、TG1菌株中的质粒，菌株中的质粒，不宜用煮沸法；不宜用煮沸法； 质粒的大小：大于大于15kb的质粒DNA易被强烈的物理或化学作用破坏，所以常选用操作过程较温和的SDS法，细菌悬浮液中含有10%的蔗糖以提高溶液的渗透压，减轻细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力。
细菌染色体DNA变性条件强弱的控制：碱法是最常用的碱法是最常用的质粒质粒DNA提取方法提取方法，它对细菌的裂解，细菌染色体DNA及蛋白质变性充分，所以提取的质粒DNA产量高、纯度好 碱裂解变性法：碱裂解变性法：1. 1. 菌体培养菌体培养：将活化的菌体接种于含一定浓度 抗生素抗生素的LB培养基中，于37C培养至对数生对数生 长期后期长期后期，然后置冰水浴20 min 1) 1) 常用的抗生素及其使用浓度常用的抗生素及其使用浓度 氨苄青霉素：（Ampericillin, Ap） 50-150 μg/ml 链霉素： （Streptamycin, Sm） 25-50 μg/ml 四环素： （Tetracycline, Tc） 10-50μg/ml 氯霉素： （Chlorampenicol, Cm）20-170 μg/ml 卡那霉素： （Kanamycin, Km） 25-50 μg/ml 2) 2) 常用的质粒载体及其起始复制序列（复制子）常用的质粒载体及其起始复制序列（复制子） 质粒质粒 起始复制序列起始复制序列 拷贝数拷贝数 pBR322 pMB1 15-20 pUC pMB1 500-700 pACYC p15A 10-12 pSC101 pSC101 5 COLE1 COLE1 15-20 3) 质粒的相关概念质粒的相关概念 严谨型质粒严谨型质粒：质粒（如：质粒（如pSC101）的复制依赖于宿主细胞）的复制依赖于宿主细胞提供的蛋白和质粒自身编码的蛋白的共同作用。
提供的蛋白和质粒自身编码的蛋白的共同作用 松弛型质粒松弛型质粒：质粒（如：质粒（如pUC系列）的复制并不需要质系列）的复制并不需要质 粒编码的功能蛋白，而是完全依赖于由宿主提供的粒编码的功能蛋白，而是完全依赖于由宿主提供的半衰期半衰期较长的酶较长的酶，当蛋白的合成停止时，复制仍然进行当蛋白的合成停止时，复制仍然进行 拷贝数拷贝数：质粒在细胞内存在的数量质粒在细胞内存在的数量 如果待提取的质粒属于如果待提取的质粒属于松弛型松弛型复制的质粒，可在扩大复制的质粒，可在扩大培养培养3-4h3-4h后，培养液中加入后，培养液中加入Cm (Cm (终浓度终浓度150-170 μg/ml)，，继续培养继续培养10h10h作用，可以达到质粒扩增的目的作用，可以达到质粒扩增的目的 ？？CmCm严重超标：严重超标： 乳品乳品、、猪肉猪肉、、水产品等水产品等 2．收集菌体．收集菌体 离心(5000g，5 min)3．细胞裂解．细胞裂解 DNA变性：悬浮于冰预冷的含葡萄糖的TE缓冲 液中加入裂解缓冲液(1% SDS, 0.2 M NaOH)4．质粒．质粒DNA选择复性选择复性 加入1/10 V浓度为3 mol/L NaAc (pH 4.8) 5. 去蛋白去蛋白 以等体积的苯酚苯酚- 氯仿氯仿抽提6．．DNA的沉淀的沉淀 加入2V的无水乙醇乙醇，室温30 min，离心(12000g，15min)，沉淀以70% 乙醇洗涤 7．沉淀溶．沉淀溶TE buffer中中 SDSSDS：分离分离DNA时常用的一种阴离子去垢剂，有时常用的一种阴离子去垢剂，有4种作用：种作用： 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂； 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； 对对RNase、、DNase有一定的抑制作用；有一定的抑制作用； SDS能够与蛋白质结合形成能够与蛋白质结合形成R-O-SO3 - …R--蛋白复合蛋白复合物，使蛋白质变性沉淀；物，使蛋白质变性沉淀； SDS分离分离DNA时，时，0.1%和和1%的的SDS的作用效果不同，前者只将的作用效果不同，前者只将RNA分离出来，后者可将分离出来，后者可将DNA和和RNA一起分离出来一起分离出来 苯酚苯酚- -氯仿氯仿- -异戊醇异戊醇（25:24:1） * 苯酚是一种蛋白变性剂，在酸性环境溶解苯酚是一种蛋白变性剂，在酸性环境溶解DNADNA。
因此，因此， 在使用前以在使用前以TrisTris碱平衡至碱平衡至pH>7.8pH>7.8 氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分离氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分离, , 异异 戊醇有助于消除提取过程中出现的泡沐抽提戊醇有助于消除提取过程中出现的泡沐抽提* 加入终浓度为加入终浓度为0.1%0.1%的的8-8-羟基喹啉，是一种抗氧化羟基喹啉，是一种抗氧化 剂，剂，RNaseRNase的部分抑制剂及金属离子的弱螯合剂的部分抑制剂及金属离子的弱螯合剂 *苯酚要重蒸饱和后才能用于苯酚要重蒸饱和后才能用于苯酚要重蒸饱和后才能用于苯酚要重蒸饱和后才能用于DNADNA的分离的分离的分离的分离 因为苯酚呈酸性，并且常常与空气接触氧化成粉红色的醌，醌能够形成游离的自由基，这种自由基能够引起磷酸二酯键的断裂，造成DNA降解直接用于DNA的分离，会使DNA遭到破坏，所以，用前需要重蒸去除氧化物，然后用Tris-HCl饱和酚，并调整pH到中性；用缓冲液饱和酚还有第二个作用，就是防止酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率 重蒸酚中加入0.1%的8-羟基喹啉及少量-巯基乙醇，目的：可以防止酚的氧化；抑制RNase活性，及金属离子的螯合作用 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNADNA的原理：乙醇使的原理：乙醇使DNA分子脱水；分子脱水； 用乙醇沉淀用乙醇沉淀DNA时，通常要在时，通常要在DNA溶液中加入单价的溶液中加入单价的阳离子，如阳离子，如NaCl和和NaAc，目的是：，目的是： 中和中和DNA分子的负电荷，增加分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力。
分子间的凝聚力 用用FastPlasmid™ 小量试剂盒分离的质粒小量试剂盒分离的质粒DNA 1-14：Marker; 2-13 ：从1.5ml HB101菌中提取的 pBluescript 质粒DNA （三）、噬菌体（三）、噬菌体DNADNA的提取的提取 （三）、（三）、 噬菌体噬菌体DNADNA的提取的提取 提提取取 DNA一一般般是是先先将将溶溶原原菌菌培培养养至至一一定定密密度度，，通通过过热热诱诱导导，，使使 DNA从从宿宿主主染染色色体体DNADNA上上释释放放出出来来，，再再经经过过溶溶菌菌周期培养，获得大量的周期培养，获得大量的 噬菌体，从中提取线性的噬菌体，从中提取线性的 DNA ① ① 溶原菌诱导培养溶原菌诱导培养 ② ② 分离分离 噬菌体噬菌体 ③ ③ DNA的提取的提取 （四）、植物细胞基因组（四）、植物细胞基因组DNADNA的制备的制备1 1．．细胞的制备细胞的制备：取新鲜的植物组织置于取新鲜的植物组织置于暗处暗处1-2 1-2 d d，以无菌水洗净后，于液氮中冻结，再用研，以无菌水洗净后，于液氮中冻结，再用研 钵研成粉末钵研成粉末2 2．．细细胞胞的的裂裂解解：加加入入抽抽提提缓缓冲冲液液（（0.1M 0.1M Tris-Tris-HCl, HCl, pH8.0 pH8.0；；0.1M EDTA0.1M EDTA；；0.25M NaCl0.25M NaCl；；100 100 g/ml Protease Kg/ml Protease K）加入终浓度为）加入终浓度为1% 1% 的的SDSSDS，， 于于5555 C C，，1–2 h 1–2 h 3. 3. DNADNA的沉淀的沉淀： 上清液中加入上清液中加入0.6 V 0.6 V 的异丙醇的异丙醇, , 于于-20-20 C C，保持，保持30min30min。
离心离心(7500g,10 min)(7500g,10 min) 4. DNA4. DNA的纯化的纯化: 沉淀中加入沉淀中加入TE TE 缓冲液和缓冲液和CsClCsCl2 2, ,冰水浴冰水浴30 min30 min 离心离心( 7500 g, 10 min)( 7500 g, 10 min) 上清液中加入上清液中加入0.5 ml(10 mg/ml)0.5 ml(10 mg/ml)的溴化乙锭的溴化乙锭 离心离心(7500 g, 10 min)(7500 g, 10 min) 上清液于室温离心上清液于室温离心(300 000 g)(300 000 g)过夜过夜, ,收集收集DNADNA带带 以以CsClCsCl饱和的异丙醇反复抽提饱和的异丙醇反复抽提 DNA, DNA,除去除去EBEB 加入两倍体积的水和加入两倍体积的水和6 6倍体积的无水乙醇倍体积的无水乙醇 离心离心(7500 g, 10 min)(7500 g, 10 min) 沉淀溶于沉淀溶于TETE缓冲液中缓冲液中 (10-40 (10-40 g g DNA/g fresh cell) ) （五）、动物细胞基因组（五）、动物细胞基因组DNADNA的制备的制备1．细胞制备．细胞制备：切下组织块并立即剪成小块，置于液氮中 冻结，然后在预冷的研钵中研成粉末。
2. 细胞裂解细胞裂解：加入消化液（1.2 ml/100 mg），充分混匀 后置于50OC振荡温育12-18 h裂解液: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0；25 mM EDTA；0.1 M NaCl； 0.5% SDS； 0.1 mg/ml Protease K．3. 去蛋白去蛋白：等体积的苯酚苯酚-氯仿氯仿-异戊醇异戊醇（25:24:1）抽提 振荡的方式混合有机相与水相振荡的方式混合有机相与水相 DNA<10 kb DNA<10 kb 10kb < DNA < 30 kb 10kb < DNA < 30 kb DNA > 30 kb DNA > 30 kb置于转鼓缓慢转动置于转鼓缓慢转动(20 r/min)(20 r/min)轻轻摇动混匀轻轻摇动混匀4 4．．DNADNA的提取：上清夜中加入的提取：上清夜中加入0.5 V0.5 V的的7.5 M7.5 M的的NHNH4 4AcAc，，2 V 2 V 无水乙醇，离心无水乙醇，离心(5000g(5000g，，10min) 10min) 沉淀以沉淀以70%70%的乙醇的乙醇 洗涤洗涤, ,5 5．．DNADNA的溶解：的溶解：DNADNA沉淀干燥后溶于沉淀干燥后溶于TETE Buffer Buffer 1 1、氯化铯、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法溴化乙锭连续梯度离心法 适于纯化大剂量适于纯化大剂量DNADNA，纯度高；但需要超速离心机、昂，纯度高；但需要超速离心机、昂贵的氯化铯、纯化时间长。
贵的氯化铯、纯化时间长 操作步骤如下：操作步骤如下： ① ① DNA溶液置于一离心管中，每毫升加溶液置于一离心管中，每毫升加1g固体氯化铯，固体氯化铯，30℃℃下缓慢溶解，再加溴化乙锭溶液（下缓慢溶解，再加溴化乙锭溶液（10mg/ml）至终浓）至终浓度度0.7mg/ml溶液中氯化铯终浓度为溶液中氯化铯终浓度为1.55g/ml，折射率为，折射率为1.3860三、三、DNADNA的纯化的纯化 ② ② 室温下室温下8000r/min离心离心5min，吸取液面浮渣下的清液，吸取液面浮渣下的清液置于一塑料离心管中，用液体石蜡盖在液面上，置于一塑料离心管中，用液体石蜡盖在液面上，20℃℃下以下以45000r/min离心离心36~40h ③ ③ 在在紫外灯下紫外灯下观察待纯化的观察待纯化的DNADNA带在DNADNA带下方用带下方用2121号针头剌穿离心管壁收集号针头剌穿离心管壁收集DNADNA ④ ④ 在收集的在收集的DNADNA液体中加入等体积、水饱和的液体中加入等体积、水饱和的正丁醇正丁醇，，充分混匀，以充分混匀，以1500r/min1500r/min离心离心3min3min，吸取下层水相。
如此，吸取下层水相如此处理处理4 4－－6 6次，直到水相液体在紫外灯下无橘红色次，直到水相液体在紫外灯下无橘红色 透析除去透析除去DNADNA液中的氯化铯液中的氯化铯 ① ① 用用三烃甲基氯化铵三烃甲基氯化铵层析树脂纯化层析树脂纯化DNADNADNADNA在低盐浓在低盐浓度（度（0.10.1－－0.5 mmol/L NaCl0.5 mmol/L NaCl）下能与树脂结合，当层析柱）下能与树脂结合，当层析柱平衡后，可用平衡后，可用0.5-2.0mmol/L0.5-2.0mmol/L的梯度浓度的梯度浓度NaClNaCl溶液洗脱溶液洗脱DNADNA，再经透析除去，再经透析除去NaClNaCl ② ② 用用羟基磷灰石羟基磷灰石纯化纯化DNADNA在低盐浓度溶液中，在低盐浓度溶液中，DNADNA和和RNARNA的磷酸基团通过与羟基磷灰石的钙离子的相互作用，的磷酸基团通过与羟基磷灰石的钙离子的相互作用，使其结合在羟基磷灰石层析柱上，随后用浓度梯度磷酸盐使其结合在羟基磷灰石层析柱上，随后用浓度梯度磷酸盐溶液洗脱和回收溶液洗脱和回收DNADNA或或RNARNA2 2、离子交换层析法、离子交换层析法 3 3、琼脂糖凝胶电泳洗脱法、琼脂糖凝胶电泳洗脱法 4 4、、““基因纯基因纯””试剂纯化试剂纯化5 5、从、从DNADNA样品中去掉样品中去掉EBEB ① ① 正丁醇（或异戊醇）抽提法：向正丁醇（或异戊醇）抽提法：向DNADNA样品溶液中加入等样品溶液中加入等体积用溶解体积用溶解DNADNA缓冲液饱和的正丁醇，轻轻混合，待上下相缓冲液饱和的正丁醇，轻轻混合，待上下相液体分开后，弃去上相正丁醇。
重复以上步骤至少一次，直液体分开后，弃去上相正丁醇重复以上步骤至少一次，直到上相正丁醇无桔红色到上相正丁醇无桔红色 ②② Dowex树脂层析法：加入树脂层析法：加入DNA样品，再用样品，再用TES缓冲液缓冲液(Tris-HCl20mmol/L，，pH8.0；；EDTA5mmol/L；；NaCl 200mmol/L)洗柱，分部收集洗柱，分部收集0.2-0.5ml组分的洗脱液，经过组分的洗脱液，经过透析和沉淀，可得无透析和沉淀，可得无EB的的DNA 1 1、乙醇沉淀法、乙醇沉淀法 在含一价阳离子的在含一价阳离子的DNADNA溶液中加入溶液中加入2 2体积的无水乙醇，使体积的无水乙醇，使DNADNA沉淀2 2、正丁醇抽提法、正丁醇抽提法 加入加入1 1体积的正丁醇，充分混匀，以体积的正丁醇，充分混匀，以1600r/min1600r/min离心离心1min1min，弃上相液体如此重复至液体达到所需要的体积然后用，弃上相液体如此重复至液体达到所需要的体积然后用水饱和的乙醚抽提水饱和的乙醚抽提DNADNA溶液两次，去除正丁醇最后空气中溶液两次，去除正丁醇最后空气中蒸发乙醚。
蒸发乙醚 3 3、用聚乙二醇浓缩法、用聚乙二醇浓缩法四、四、DNADNA的浓缩的浓缩 五、利用五、利用PCRPCR制备特异的制备特异的DNADNA片段片段 1.1.原理：原理： PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）在耐热DNA聚合酶的催化下，以变性的双链DNA中的一条链为模板合成互补的DNA链2.2.反应系统反应系统: : 耐热DNA聚合酶，DNA模板，dNTPs, 引物，Mg2+ 3.3.反应过程：反应过程： 变性变性：双链DNA在高温(94C)下变性为单链DNA 退火退火复性：在较低的温度(37-65C)下,引物与变性的单 链DNA通过碱基互补作用而特异性地结合 DNADNA延伸延伸：在较高温度下(70-75C)下,耐热DNA聚合酶催 化互补链从引物3’-OH端开始沿5’–3’方向合成互补链 利用利用PCR扩增特异性扩增特异性DNA片段过程片段过程 PCR反应液组成反应液组成PCR反应条件反应条件 PCR反应结果反应结果 第二节第二节 RNA RNA的制备的制备 来来源源于于任任何何细细胞胞的的RNARNA都都可可以以通通过过反反转转录录酶酶的的作作用用拷拷贝贝成成双双链链DNADNA并并克克隆隆化化，，获获得得相相应应的的于于特特定定细细胞胞来来源源的的cDNAcDNA文文库库。
因因此此，，RNARNA制制备备的的意意义义有两个方面：有两个方面： * * 获得特定细胞来源的获得特定细胞来源的cDNAcDNA文库，克隆目的基因文库，克隆目的基因 * * 分析基因的表达，阐明基因调控的特性，了解从基因分析基因的表达，阐明基因调控的特性，了解从基因 转录产生转录产生RNARNA的结构，数量，水平及合成的速率的结构，数量，水平及合成的速率 RNA分离的最关键因素是尽量减少分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染酶的污染RNA酶的特点及其存在形式：酶的特点及其存在形式：• •特点特点特点特点： 是一类生物活性非常稳定的酶类；耐热、耐酸、耐碱；煮沸也不能完全失活；蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性 RNase的活性不需要辅助因子，二价金属离子螯合剂对它的活性无影响• •存在存在存在存在： 细胞内RNase；环境中灰尘、人体的汗液、唾液；实验中RNase造成的污染，污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及试剂等• •措施措施措施措施： 严格控制外源性RNase的污染；最大限度的抑制内源性RNase的活力 抑制抑制RNA酶活性的方法酶活性的方法1.灭菌法灭菌法： 将RNA提取过程中使用的器具器具进行高温灭菌处理(180 ºC，8h)， 溶液溶液等在高压下蒸汽灭菌15min (1.034 105 Pa)2. 焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC））抑制法抑制法： DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，塑料或玻璃器皿在含0.1%的DEPC溶液中浸泡2h，然后以灭菌水淋洗数次，在100 ºC下干烤15min。
抑制抑制RNA酶活性的方法酶活性的方法 利用RNA酶蛋白质抑制剂酶蛋白质抑制剂与RNA酶紧密结合防止其发挥酶活作用； 利用氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物与RNA酶结合； 利用硅藻土硅藻土吸附RNA酶3. RNA酶抑制剂法酶抑制剂法： 一、细菌一、细菌RNARNA的制备的制备1 1．菌体培养．菌体培养 同上2. 2. 离心收集菌体离心收集菌体 菌体经离心（5000g，5min）后，悬浮于终止 缓冲液中（200mM Tris-HCl，pH8.0; 20 mM EDTA; 20 mM Na2N3; 20 mM 金精三羧酸(ATA)）3. 3. 菌体裂解菌体裂解 加入STET缓冲液(8%蔗糖; 5% Triton X-100; 50mM EDTA; 50mM Tris-HCl pH 7.0)悬浮加 入0.2M的VRC(0.2M和10mM的氧氧钒钒核核苷苷复复合合物物) 4. RNA4. RNA提取提取 加入0.5 V的苯酚振荡1 min，0.5 V氯仿振荡1 min，10000g，10min,水相加入1/10 V的NaAc， 2 V的无水乙醇10000g，10 min沉淀溶于0.2 M 的VRC，以酚-氯仿抽提两次5. RNA5. RNA纯化纯化 重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水中，加 入CsCl溶液，于室温离心(200 000g,1h)回收RNA 沉淀,溶于DEPC处理的水中，加入1/10 V的3M的 NaAc，2 V的乙醇，离心6 6．RNARNA的溶解的溶解 将RNA沉淀溶于水中 二、植物组织细胞二、植物组织细胞RNARNA的制备的制备1.1.细胞处理细胞处理: 将植物组织置于液氮中冻结，研 成粉末，加入匀浆缓冲液，高速匀浆，后高速 离心（20000g，10 min） 2.RNA2.RNA提取提取：上清液中加入皂土皂土(4%),等体积的酚, 低温振荡5min，200000 g、10 min3.3.重复该步骤一次重复该步骤一次4.RNA4.RNA沉淀沉淀: 于上清液中加入KAc至终浓度为0.2 M,加两倍体积的无水乙醇,于0ºC 30 min， 30000g、20 min5 5．．RNARNA的溶解的溶解：沉淀溶于水中或TE缓冲液 三、哺乳动物细胞质三、哺乳动物细胞质RNARNA的制备的制备1 1．细胞培养．细胞培养: 人工组织培养2 2．细胞裂解．细胞裂解：以含磷酸缓冲液（PBS）的生理盐 水洗细胞悬浮于预冷的溶胞缓冲液中，加入 24%的蔗糖，1%的NP-40溶胞缓冲液3 3．去蛋白．去蛋白： 加入Protease K，于37 ºC温育30 min，酚抽提4 4．．去去DNADNA：乙醇沉淀,悬浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS)5. 5. 沉淀沉淀RNARNA: 加入终浓度为0.3 M的NaAc, 2V无水乙醇于-20 ºC 2h, 离心收集RNA。
四、四、mRNAmRNA的分离提纯的分离提纯——寡聚寡聚(dT)-(dT)-纤维素柱法纤维素柱法上柱缓冲液上柱缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl (pH7.6) 0.5 mol/L NaCl 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 0.1% 十二烷基肌氨酸钠洗脱缓冲液洗脱缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 0.05% SDS 寡聚寡聚(dT)-(dT)-纤维素柱法提纯纤维素柱法提纯mRNAmRNA的过程的过程柱平衡柱平衡（以上柱缓冲液洗脱纤维素柱，至柱流出液 的pH值小于8.0)装柱装柱( RNA水溶液于65OC温育5min，迅速冷却后按1V RNA水溶液 + 1V 上柱缓冲液（2）混合装柱预洗预洗(以5-10V的上柱缓冲液上柱缓冲液将未与柱结合的RNA等 洗脱下来，至OD260为很小或为零）洗脱洗脱(以2-3V的无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱缓冲液洗脱柱，并进 行分部收集)沉淀沉淀(1/10 V的3M NaAc，pH5.2；2V 无水乙醇； 置于冰浴中至少30min)溶解溶解 (重蒸水或TE中) RNA干扰干扰 RNA interfering •2006年10月2日，47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔医学奖获得者。
颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制， 解释了困惑这一研究者们许久的难题 “像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了” 五、五、RNA定量与质量鉴定定量与质量鉴定• RNARNA定量方法定量方法定量方法定量方法与DNA定量相似： RNA在260nm波长处有最大的吸收峰；因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为值为1相当于大约相当于大约40 g/ml的单链的单链RNA； 如用1cm光径，用ddH2O稀释RNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度： RNA (mg/ml) = 40 OD260读数读数 稀释倍数稀释倍数(n)/1000 • •RNARNA质量鉴定：质量鉴定：质量鉴定：质量鉴定： RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度 纯化的RNA A260/A280的比值通常在1.7-2.0； 如果该比值低于低于1.7 ，说明有残余蛋白质存在，则需进一步纯化RNA；比值太高比值太高，则提示RNA有降解。
• •RNARNA完整性完整性完整性完整性的检测可通过琼脂糖变性凝胶电泳实施； 28S和18S真核细胞RNA比值约为2：1，表明无RNA降解； 如该比值逆转，则表明有RNA降解，因为28S rRNA可特征性的降解为类似的8S的RNA 金钗石斛花芽总金钗石斛花芽总RNA的的1%变性琼脂糖凝胶电泳图变性琼脂糖凝胶电泳图 August 12, 2005 issue of Cell" A powerful new tool for decoding gene functions in mammals and ManTian Xu, Yale University, Fudan University 破解天书的密码名叫“PBPB转座因子转座因子”这种源于飞蛾的“密码”能直接插入哺乳类动物的基因中并保持活性、导致基因突变，有了这个基础，研究人员就能从突变中了解某个基因的特定功能他们曾尝试用这类因子直接插入小老鼠受精卵的某个基因中，结果发现长大后基因突变的小老鼠患上了肾病，由此，他们判断这类肾病与这个特定基因基本上存在直接关联据悉，在目前复旦已公布的70个特定基因中，研究人员已经基本能确定这些基因的基本功能。
让研究人员惊喜的是，“PB转座因子”甚至还能携带一些能携带一些““外部外部””基因进入哺乳动物的基因内部基因进入哺乳动物的基因内部科研人员通过这类因子将荧光蛋白携带入小老鼠的受精卵内，这样小老鼠长大后，外部基因对哺乳动物的生命体征的影响就一目了然———整只小老鼠的皮肤和眼睛在荧光灯下发出幽幽的红光，而这样的“荧光”基因还将一代一代地遗传下去 Mother mouse and its offspring with the PB transposon expressing the red fluorescence protein. 。