本科毕业论文开题报告药学青鲨软骨血管生成抑制因子的制备III一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义我国蕴藏着丰富的海洋生物资源现已证实，不少海洋生物活性物质具有抗 肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗艾滋病、抗心脑血管疾病、抗老年痴呆症以及抗疲 劳、增强免疫、延缓衰老等功效由此引起世界各国对开发海洋生物的极大兴 趣，它己成为现代医药保健品开发研究的热点⑴近年来，肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是仅次于心脑血管疾病危害人 类健康的第二大杀手据统计，全世界每年约有700万人死于癌症，约占总死亡 人数的四分之一⑵目前，已有许多抗肿瘤药物应用于临床，但多因其副作用大 而在应用上受到限制因此，人们逐渐将注意力转向从动植物中提取副作用小的 抗肿瘤有效成分近20年来发现鲨鱼的整个内骨骼几乎全由软骨组成，并且鲨鱼 不长肿瘤，推论鲨鱼体内存在某种抑制肿瘤生长的物质⑶1对肿瘤细胞的杀伤作用在鲨的软骨中存在抗肿瘤因子，可直接杀伤肿瘤细胞，抑制细胞骨架的形成 或使细胞骨架发生凝聚和固缩，破坏其结构完整性⑷2对新生血管生长的抑制作用鲨鱼软骨蛋白可以抑制鸡胚胎血管化和基质胶诱导的血管生成，抑制乳腺癌 和人恶性胶质瘤的生长，阻止乳腺癌和Lewis肺癌的转移。
软骨的这种作用可能 与其抑制金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的作用有关⑸3抗氧化作用鲨鱼软骨中提取的一种水溶性组分具有抗炎和止痛作用这种组分能清除活 性氧自由基，保护细胞不发生突变，间接起到抗肿瘤作用⑹4增强机体免疫力鲨鱼软骨活性物质抗肿瘤的另一原因是其可以激活机体的免疫系统，活化 NK细胞及巨噬细胞以增强攻击癌细胞的能力活性物质通过抑制致敏红细胞，刺 激CD疽和CD8+渗入肿瘤细胞增强迟发型超敏反应，从而增强免疫应答⑺鲨鱼 软骨多糖对胸腺和脾脏具有刺激作用，同时能活化巨噬细胞，使其表面伸出较粗 大的伪足，提高机体的免疫力，刺激白细胞分泌TNF[8]o国内外愈来愈多的研究证实，鲨色软骨含有能阻止病理性血管生长的特殊 物质，从而断绝肿瘤的血液供应，使肿瘤减缓生长，萎缩甚至消失，抗癌作用显 著而且对类风湿性关节炎等顽疾也有效⑼我国医药界有识之士已经开始注重 在全国范围内推广鳌鱼软骨的应用研究，造福众多的癌症患者及多种顽疾患者以肿瘤血管为治癌新靶这一全新治癌理论的创立和抑制肿瘤新生血管的有效 物质——鲨鱼软骨的最新发现为整个医学界乃至全人类带来了最终攻克癌症的希 望和曙光青鲨属脊椎动物门、软骨鱼纲、真鲨门、真鲨科、大青鲨属，俗称蓝 鲨、大青鲨。
青鲨是一种世界上最普遍也是分布最广的鲨鱼，几乎遍及热带和温 带海域1983年美国麻省理工学院Lee A博士和Langer R博士用鲨鱼软骨进行抑 制肿瘤实验，在Science杂志上发表文章，称在鲨鱼软骨中含有一种肿瘤血管抑 制因子，证明鲨鱼软骨具有一定的肿瘤抑制作用抑制血管生成，切断肿瘤的营 养供应及转移途径，抑制肿瘤的生长和转移，是一条很有希望的肿瘤治疗新途径 1101 o本课题从青鲨软骨中分离纯化出具有较强抗氧化活性的蛋白，并对其抑制新 生血管的能力进行了比较分析因此，本课题的研究，将为海洋资源丰富的软骨 资源高值化利用开辟•一条新的途径，为后续开发高效低毒保健的海洋抗肿瘤新药 奠定基础二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：1、研究的基本内容：采用硫酸铉沉淀法进行青鲨软骨总蛋白的制备，再经 离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析分离纯化，随后进行抗氧化活性测定 试验，包括清除羟自由基，还原力的测定等指标，用电泳法测定青鲨软骨血管抑 制因子的分子量，再进行青鲨粗品(60%BSF)、青鲨离子交换(BSFL)、青鲨凝胶过 滤(BSFN)抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的测定。
2、拟解决的主要问题：用硫酸铉沉淀法制备青鲨软骨的粗提物，纯化精制，抗氧化活性的测定以及用电泳法测定青鲨软骨血管抑制因子的分子量比较 青鲨粗品（60%BSF）、青鲨离子交换（BSFL）、青鲨凝胶过滤（BSFN）抑制CAM膜 新生血管生成效果哪个更明显三、研究步骤、方法及措施：确定研究对象（舟山海域常见食用鱼类生物青鲨）1、 青鲨软骨组织破碎后于PBS浸提，低温离心，（NH4）2SO4分级沉淀得粗蛋 白2、 通过离子交换层析（IEC）和凝胶层析（GFC）进行分离纯化获得活性蛋白 组分及单体3、 抗氧化活性的测定（1） 清除DPPH自由基的能力DPPH自由基清除能力测定按照Bersuder （1998）等回描述的方法进行取一 份ImL样品与ImL的99.5%乙醇混合，加入浓度为0.02%的DPPH 99.5%乙醇液 250 |1L于同一具塞试管中摇匀将混合物在暗室室温下放置60min,于517nm处 测定吸光度结果见表3以上述所配置的溶液按照下述的方法每个实验平行进 行三次，取其平均值，计算相对标准偏差RSDo ）自由基清除率按照下面公式计算：清除率％=（对照+空白•样品）/对照对照：ImL蒸馅水+lmL乙醇+250口1_浓度为0.02% DPPH 99.5%乙醇溶液；样品：ImL样品+lmL乙醇+250|iL浓度为0.02% DPPH 99.5%乙醇溶液；空白：ImL样品+lmL乙醇+250pL乙醇。
2） 还原力的测定水解液还原力测定按照1988年OyaizuM使用方法进行取2mL样品溶液于试 管中,依次加入2mL0.2mol/L（pH6.6）磷酸盐缓冲液、2 mL的1%铁氤化钾溶液, 充分混匀后在50C保温20min,接着再加入2mL10%的三氯乙酸（TCA）溶液，离 心，取出2mL上清液于另一•试管中，再加入2mL蒸馅水和0.4mL0.1%三氯化铁溶 液进行反应，lOmin后于700nm处测定吸光度，吸光值越高表明还原力越高结 果见表4以上述配置的溶液每个实验做三个平行组，取平均值，计算相对标准 偏差RSDo ）（3）清除羟自由基的能力的测定【13*1取ImL浓度为0.75mmol/L邻二氮菲装于试管中，再加入2mL PBS（pH7.4）, ImL蒸馄水，完全混匀后，加入浓度为0.75mmol/L的硫酸亚铁ImL,混匀，加 ImL质量分数为0.12%的H2O2，37C水浴反应90 min,于536nm处测其吸光度， 为Ap；用蒸保水ImL代替lmLH2O2,为Ab；用样品代替ImL的蒸儒水，为A’结果见表5以上述配置的溶液每个实验做三个平行组，取平均值，计算其相对 标准偏差RSDo )样品对羟自由基清除率按照下面公式计算：样品对羟自由基清除率=(As-Ap)/(Ab-Ap)xl00%4、 进行青鲨粗品(60%BSF)、青鲨离子交换(BSFL)、青鲨凝胶过滤(BSFN) 抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的测定。
5、 撰写实验报告与论文四、参考文献[1] 缪辉南，方旭东,焦炳华.海洋生物资源开发研究概况与展望[J].氨基酸和生物资 源，1999,21(4):12-18.[2] 于慧,宋爱云，丁兰萍等.恶性肿瘤病因研究进展[J].肿瘤基础与临床,2003,16(5): 388-390.[3] 田志强，姬胜利.鲨的软骨与肿瘤的关系[J].食品与药品,2005,7(6):19-22.⑷ 沈先荣，吉冬梅，胡幼卿等.血管生成抑制因子SCAIF80及其抗肿瘤效应[J].生物化 学与生物物理学报,2001,33⑴:99-104.[5] 郭斌，韩冠英，李智.鱼软骨多糖对Lewis肺癌MMP29表达的影响[J].中国中药杂 志，2006, 21(4):325-328 .[6] Felzenswalb I.Pelielo de Mattos JC ,Bernardo-Filho M,et al.Shark cartilage - containing preparation : protection against reactive oxygen species[J].Food Chem Toxicol,1998, 36(12): 1079-1082.[7] Hassan ZM,Feyzi R,Sheikhian A ,et al .Low molecular weight f raction of shark cartilage can modulate immune responses and abolish angiogenesis[J].lnt lmmunopharmacol,2005,5 (6):961-970.[8] Simjee SU,Smith SL. Shark cartilage - stimulated secretion of the tumor necrosis factor by human leukocytes [J].Dev Comp Immunol ,1997, 21(2):170-171.[9] 钱蔚，贺莲，秦惠基.鲨鱼软骨的药用开发前景[J].医学研究通讯,1998, 27(5):29-30.[10] 尚俊英，谢裕安，杨帆.鲨鱼软骨低分子蛋白的提取及其抑制新生血管形成的 初步研究[J].广西医学,2008, 30(2): 156-158.[11] Bersuder P, Hole M, Smith G. Antioxidants from a heated histidine-glucose model system. I. Investigation of the antioxidant role of histidine and isolation of antioxidants by high performance liquid chromatography [J]. Journal of American Oil Chemists Society, 1998, 75: 181-187.[12] Oyaizu, M. Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography [J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1988, 35, 771-775.[13] 李进，瞿伟菁，张素军等.黑果枸杞色素的抗氧化活性研究[J].中国中药杂志, 2006, 31 (14): 1179-1184.[14] 赵二劳，张海容，盖青青等.沙棘黄酮的测定及其抗氧化作用[J]・化学研究与 应用,2003, 15(2): 284-285.[15] 金鸣，蔡亚欣，李金荣等.邻二氮菲2Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由 基[J]・生物化学与生物物理进展,1996, 23(6): 553-555.五、研究工作进度：2010年12月〜2011年2月：下达任务书，收集资料和完成实验的前期内容； 2011年3月〜2011年4月：通过实验，进行青鲨软骨血管生成抑制因子的制备； 2011年4月〜2011年5月：总结实验数据，撰写毕业论文；2011年5月：毕业答辩。
毕业论文文献综述药学鲨鱼软骨生理活性成分的研究［摘要］恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一，许多研究者己从多种动 物的软骨中发现了相对分子量不等的抑制肿瘤生长的活性因子存在鲨鱼软骨抗 肿瘤生理活性成分分为三类：①血管生成抑制因子，②抗肿瘤因子，③抗入侵因 子鲨鱼软骨在抑制肿瘤血管形成、直接杀伤肿瘤细胞、清除自由基及调节机体 免疫等方面所起的作用，这一发现为人类最终战胜癌症起到一定作用［关键词］鲨鱼软骨；抑制肿瘤；生理活性。