PCR 最新技术 原理及应用polymerase chain reaction)-：PCR的基本成分PCR包括7种成分：模板DNA,特异性引物，热稳定DNA聚合酶, 脱氧核昔三磷酸(dNTP),二价阳离子，缓冲液及一价阳离子―)：模板DNA：待扩增的核酸序列基因组DNA,质粒DNA, 噬菌体DNA,预先扩增的DNA, cDNA和mRNA等儿乎所有形式的 DNA和RNA都能作为PCR反应的模板)：特异性引物：与靶DNA的了端和5,端特异性结合的寡核昔 酸片段，是决定PCR特异性的关键只有当每条引物都能特异性与 模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性引 物越长，对丁靶序列的特异性也越高引物特异性及优化设计特性：碱基组成 G+C含量应在40%〜60%, 4种碱基耍分配均匀长度 一般为18~25个核昔酸的长度，上下游引物长度差别不能大于3bp.重复及口身互补序列 不能有大于3bp的反向重复序列或口身互补序列存在上下游引物的互补性一个引物的3,端序列不能结合到另--个引 物的任何位点上解链温度(Tm) 两个引物的Tm值相差不能大于5摄氏度，扩增 产物与引物的Tm值不能大于10摄氏度。
3,末端 尽可能使每个引物的3,末端碱基组成为G或C或，但不能为有NNCG或NNGC序列三）热稳定性DNA聚合酶：是PCR技术实现自动化的关键（四）脱氧核营三磷酸：标准PCR反应体系中包括四种等摩尔浓度 的脱氧核苗三磷酸，dATP, dTTP, dGTP, dCTP 在常规PCR反应液中，每种dNTP的浓度一般 是在200-500umol/L之间高浓度的dNTP （＞4mmol/L）,对扩增反应有抑制作用五） 二价阳离子：所有的热稳定DNA聚合酶都耍求有游离的二价阳离子常用的是Mg或Mn由于dNTP和寡 核营酸都能结合Mg,因而反应体系中阳离子的 浓度必须超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的 摩尔浓度六） 缓冲液：维持PCR反应体系的PH,必须用Tris-HCL缓冲液标准PCR缓冲液中的浓度为10mmol/L,在室温 将PCR缓冲液的PH调至8.3〜8.8之间七） 一价阳离子：标准的PCR缓冲液溶液中包含有50mmol/L的KCL,它对于扩增大于500bp长度的DNA片段 是有益的，提高KCL浓度到70〜100mmol/L,对 于改善扩增较短的DNA片段也是有益的—：PCR的基本操作:PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。
一个循环过程有三 个步骤；（1）变性，通过加热使模板DNA完金变性成为单链，同时引物口身和引物之间存在的局部双链也得以清除；（2）退火，将温度下降至适宜的温度，使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链 延伸一） 变性：双链DNA模板的变性温度由其G+C的含量决定， 模板DNA的G+C的含量越高，熔解温度也越高变性的时间由模板DNA分子的长短决定在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94〜95°C条件 下进行对于G+C的含量＜=55%线性DNA模板，常规PCR的变性条件是94〜95变性40s.当模板G+C的含量＞55%吋则需要更高的温度一步 PCR一步RT-PCR是指在同一管子中，利用同一种优化的反冲液， 在反转录酶和热稳定DNA聚合酶等的存在-卜•，直接以RNA或mRNA 为起始材料进行RT和PCRo 一步PCR中,热稳定DNA聚合酶活性 在整个过程反应过程中起决定性的作用原理一：热稳定DNA聚合 酶活性在反转录过程中被其抗体所抑制在较低温度的RT反应中， 热稳定DNA聚合酶没有活性；RT反应结束后，PCR a程中对模板 变性所用的高温（94〜95°C）使反转录酶失活，同时也使热稳定DNA 聚合酶抑制物失活。
原理二：一步RT-PCR中只有一种酶，且是热稳 定DNA聚合酶（如TthDNA聚合酶）引物设计：一步RT-PCR所用的引物为基因特异引物反转录酶好和DNA聚合酶：使用缺乏RnaseH活性以及活性较低 （AMV 和 M-MLV 突变体，Super Scriptll, Strata Script 反转录酶）；TthDNA聚合酶，既有DNA聚合酶活性，又反转录酶活性，但它合 成的cDNA长度较短，保真度相对较低所使用的热稳定DNA聚合 酶（TITANIUM Taq, Platinum Taq, Taq-Plus Precision DNA 聚合酶）常规RT-PCR和一步PCR的应用：常规RT-PCR的技术应用：(-)制备用于杂交的cDNA探针：在某些情况下，需用RT-PCR法 制备cDNA探针，因为该法无须获得cDNA克隆，从克隆中酶切 物回收cDNA片段和对片段进行标记，可用两种制备cDNA探针:(1)在PCR过程中，掺入用同位素或其他物质标记的dNTP,但 需耍较多的dNTP； (2) PCR扩增后，PCR产物用同位素或其他 物质进行标记，所需标记的dNTP较少)选择性剪接转录物的检测：在某些情况下，mRNA可被选择性 剪接，有时包含一个外显子，有时无此外显子。
因此，用此外显 子两侧的序列作物，用PCR可扩增出两条不同大小的片段例如: 鼠转录因子fosBcDNA编码区存在两种剪接形式，经RT-PCR反应 后，可获得1250bp和llOObp的cDNA片段，后者的编码产物可 抑制fos/jun转录因子的正常功能PSM与有丝分裂有关，位于包 括胰岛素，胰岛素样生长因子I (IGF-I)，血小板延伸的生长因子 (PDGF)，神经生长因子，肝细胞生长因子，成纤维细胞生长因子 受体在内的生长激素受体和受体络氨酸激酶的下游用RT-PCR 从小鼠脑细胞中分离得到四种PSM选择性剪接转录物，分别编码 四种不同分子量的蛋白质(1, 2, 3, 4),它们对有丝分裂信号应 答由强到弱的次序为：3, 4, 1, 2.o利用RT-PCR技术从人前列 腺癌细胞株中分离出5种差异表达的雌激素受体(ER)选择性剪接 转录物，其中3种为新型ER变异体功能分析表明，所有的ER变异体均丧失了形成同源或异源二聚体的能力和转录激活活性三）5,端和3,端序列的快速克隆（RACE）在分子生物学研究中，经常会遇到获得的cDNA序列不完整，尤 其经常缺少CDNA59端造成这种情况的原因有多种：如在cDNA 文库的构建过程中反转录合成cDNA不完整；起始mRNA模板过 长；mRNA模板的二级结构含量过多。
利用RT-PCR原理，包括 三大步骤：RT,,同聚物加尾和PCR扩增，59-RACE.o技术耍求待 扩增的cDNA的部分序列是己知的，这样使cDNA序列特异引物 与mRNA配对在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，在末端 转移酶的作用下使该cDNA第一链歹端加上同聚物尾巴，以与同 聚物尾巴互补的序列为引物合成cDNA第二链，然后在接头序列 和cDNA序列特意引物存在下，PCR扩增Cdna5;端由于cDNA 的亍端是由各种长短不一的靶mRNA的亍端序列延伸而来，因此 55-RACE的产物大小不一，在特异性较好的情况下，应选取长度 最长的产物，以便获得完整的CDNA59端红细胞膜ABO抗原的表达受FUT1基因调节，RT-PCR结果显示, FUTlmRNA在骨髓细胞，红系白血病细胞和高度未分化的白血病 细胞中表达为进一步分离FUT1CDNA5,端，采用59-RACE技术 从白血病细胞株中扩增该CDNA59端首先在反转录酶作用下将骨 髓细胞，红系白血病细胞或卵巢癌细胞来源的lug poly（A） mRNA 反转录成cDNA,在3,端加上同聚物尾巴，然后用1/50的cDNA 产物以接头引物和FUT1基因特异引物进行PCR扩增。
在骨髓细 胞和红系口血病细胞中分别获得了两种和四种不同大小的5，端 cDNA,但它们的转录起始位点相同；在卵巢癌细胞中获得7种不 同大小的亍端cDNA,并有2个转录起始位点3,端CDNA-RACE:：首先以与poly(A)尾巴互补的序列【即接头序 列+oligo(dT)】为引物，在反转录酶作用下合成cDNA第一端,在 以靠近cDNA3,5端的序列为特异引物合成cDNA第二链，然后在 cDNA序列特异引物和接头引物序列存在下下PCR扩增3,端 cDNAo多标志物RT-PCR多标志物RT-PCR反转录一般以oligo(dT)或随机六聚寡核营酸 为引物在PCR过程中则需设计多对基因特异引物以扩增多个基 因表达产物应用：多标志物RT-PCR常用于肿瘤的检测：外周血细胞可用来检测隐藏的乳腺癌细胞，以mRNA上的绒毛膜促 性腺激素亚单位b-Hcg,癌基因c-Met,神经节甘脂生物合成途径酶 GalNAC-T和高免疫原性蛋白MAGE-A3为标志物提取RNA后， 用oligo(dT)引物进行反转录PCR条件为：95变性5min后，按95°C 变性lmin (适用于c-Met和MAGE-A3)或65°C (适用于b-hCG和 GalNAC-T)退火lmin。
72°C延伸lmin,进行35个循环，最后72°C 延伸lOminoCAI9-9通常被用来评价胰腺癌临床状况和疗效但该标志物在良性 胰腺疾病和肝病变中的表达水平也上升目前还没有一个标志物是胰 腺特异的运用多标志物RT-PCR检测组织和外周血中转移的胰腺癌 细胞，采用 3 个 mRNA 标志物(GalNAGT, c-Met , b-Hcg)o。