专题精研课,12,PCR,技术中引物的拓展应用,高考总,复习优化设计,GAO KAO ZONG FU XI YOU HUA SHE JI,2026,应用一利用,PCR,技术鉴定目的基因的连接方式,检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤,可以借助载体上的标记基因、,PCR,技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因在实际操作中,PCR,技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式专项突破,1,.(2024,山东青岛期末,),某研究小组构建了能表达,ACTA1GFP,融合蛋白的重组质粒,该重组质粒的部分结构如下图所示下列叙述错误的是,(,),注,:F,1,和,F,2,表示上游引物,R,1,和,R,2,表示下游引物A.RNA,聚合酶与启动子结合,调控,ACTA1,基因和,GFP,基因的表达,B.,使用,F,2,和,R,2,一对引物,可以确定,ACTA1,基因插入方向是否正确,C.,ACTA1,基因转录的模板链是,a,链,引物,F,1,与,b,链的部分序列相同,D.,为了减少,PCR,中非特异性条带的产生,可以适当升高复性的温度,B,解析,据图可知,ACTA1,基因和,GFP,基因位于启动子和终止子之间,故,RNA,聚合酶与启动子结合,调控,ACTA1,基因和,GFP,基因的表达,A,项正确,;,据图可知,引物,F,1,、,R,2,或,F,2,、,R,1,结合部位包含,ACTA1,基因的碱基序列,因此推测为了确定,ACTA1,基因连接到质粒中且插入方向正确,进行,PCR,检测时,若用一对引物,应选择图中的引物,F,1,、,R,2,或,F,2,、,R,1,B,项错误,;,ACTA1,基因转录的模板链是,a,链,引物,F,1,与,b,链均可以和,a,链互补配对,二者部分序列相同,C,项正确,;,非特异条带增加的原因可能是复性温度过低,造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少反应中非特异性条带的产生,D,项正确。
应用二利用,PCR,技术引导基因定点突变,重叠延伸,PCR,技术是指在,PCR,技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使,PCR,产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用专项突破,2,.(2024,福建福州期末,),通过设计引物,运用,PCR,技术可以实现目的基因的定点诱变下图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物,1,序列中含有一个碱基,T,不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物,1,和引物,2,的,5,端分别设计增加限制酶,a,和限制酶,b,的识别位点下列有关叙述正确的是,(,),A.,在该,PCR,反应体系中还需要加入,4,种游离脱氧核苷酸、解旋酶、耐高温的,DNA,聚合酶等,B.,第,2,轮,PCR,引物,1,能与图中,结合并且形成两条链等长的突变基因,C.,引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体,D.,第,3,轮,PCR,结束后,含突变碱基对且两条链等长的,DNA,分子占,1/2,答案,C,解析,PCR,反应体系中还需要加入,4,种游离的脱氧核苷酸、耐高温的,DNA,聚合酶,直接利用高温解旋,不需要加解旋酶,A,项错误,;,第,3,轮,PCR,引物,1,能与图中,结合并且形成两条链等长的突变基因,B,项错误,;,引物中设计两种限制酶识别位点,可以配合载体的限制酶识别位点,帮助目的基因定向定点插入运载体,避免发生自身环化,C,项正确,;,第,3,轮,PCR,结束后,含突变碱基对且两条链等长的,DNA,有,2,个,而子代,DNA,有,2,3,=8,个,故含突变碱基对且两条链等长的,DNA,占,1/4,D,项错误。
应用三利用,PCR,技术扩增未知基因序列,利用,PCR,技术进行基因扩增时,为了便于设计引物,要求目的基因两侧的序列是已知的当,DNA,的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向,PCR,技术专项突破,3,.(2024,广西南宁二模,),常规,PCR,只能扩增两引物之间的,DNA,序列,要扩增已知,DNA,序列两侧的未知,DNA,序列,可用反向,PCR,技术反向,PCR,技术扩增的原理如图所示下列叙述错误的是,(,),A,.,酶切阶段,L,中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列,B.,环化阶段,可选用,E.coli,DNA,连接酶或,T4 DNA,连接酶,C.,图中引物,应选择引物,1,和引物,4,且二者间不能互补配对,D.PCR,扩增,将温度调至,72,的目的是使引物与模板链结合,D,解析,在酶切阶段,已知序列,L,中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列,否则会将已知序列,L,切断,造成序列识别混乱,A,项正确,;T4,DNA,连接酶或,E.coli,DNA,连接酶都可以用来连接黏性末端,因此环化阶段,可选用,E.coli,DNA,连接酶或,T4,DNA,连接酶,B,项正确,;PCR,过程需要两种引物,能分别与目的基因两条链的,3,端通过碱基互补配对结合,为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列,应该选择引物,1,和引物,4,且二者间不能互补配对,C,项正确,;PCR,扩增中,将温度调至,72,的目的是耐高温的,DNA,聚合酶将四种脱氧核苷酸,根据碱基互补配对原则合成新的,DNA,链,D,项错误。
应用四利用,PCR,技术快速检测病原体,病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段,为迅速而准确地确定病原体的存在和种类,发展了许多快速检测方法PCR,技术是一种基于,DNA,扩增原理的快速病原体检测方法,它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体,DNA,并且具备高度的特异性和敏感性专项突破,4,.(2024,湖北华中师大附中高三模拟,),幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌,其骨架蛋白,MreB,通过影响脲酶活性而参与调控其致病性为了更准确地分离出,MreB,蛋白,用重叠延伸,PCR,技术,(,指在,PCR,技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使,PCR,产物形成重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术,),将幽门螺杆菌,MreB,基因中编码终止密码子前的,DNA,序列与,TAP,标签,(,可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因,且不会影响基因的表达,),进行连接,构建了融合表达蛋白,MreB,和,TAP,标签的质粒,实验流程如图所示据图回答下列问题1),重叠,PCR,获得带有标签的,MreB,基因,获得两种具有重叠片段,DNA,的过程中,PCR1,和,PCR2,必须在不同的反应体系中,原因,是,_,_,_,。
PCR3,反应体系中所加入的引物是,引,物,2,和引物,3,中存在互补配对的片段,置于同一反应体系时,它们会发生结合而失去作用,引物,1,、引物,4,(2),重组质粒的构建,为将带有标签的,MreB,基因定向插入,pK18mobSacB,质粒中,需要在引物末端添加限制酶识别序列,据图分析,在引物,1,添加的序列所对应的限制酶是,在引物,4,添加的序列所对应的限制酶是,经过这两种酶酶切的带有标签的,MreB,基因和,pK18mobSacB,质粒进行连接时,可选,用,(,填,“,E,.,coli,DNA,连接酶,”,或,“T4 DNA,连接酶,”),重组质粒中,Km,R,基因的作用,是,Sma,Xho,T4 DNA,连接酶,鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来,解析,(1),重叠延伸,PCR,技术是指在,PCR,技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使,PCR,产物形成重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术,引物,2,和引物,3,中存在互补配对的片段,置于同一反应体系时,它们会发生结合而失去作用分析题意可知,PCR3,是为了获得带有标签的,MreB,基因,所以应选择引物,1,和引物,4,。
2),要将带有标签的,MreB,基因定向插入,pK18mobSacB,质粒中的启动子与终止子之间,Eco,R,在启动子两侧均有其切割位点,因此不能选择,Eco,R,在引物,1,添加的序列所对应的限制酶只能是,Sma,在引物,4,添加的序列所对应的限制酶只能是,Xho,;,Sma,切割后产生平末端,经过这两种酶酶切的带有标签的,MreB,基因和,pK18mobSacB,质粒进行连接时应选择,T4,DNA,连接酶重组质粒中,Km,R,基因是标记基因,其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来应用五,DNA,片段电泳与遗传试题的综合,DNA,分子具有可解离的基团,在一定的,pH,下,这些基团带有正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳不同大小的,DNA,片段迁移速率不同,凝胶中的,DNA,分子通过染色可在波长为,300 nm,的紫外灯下被检测出来因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化,DNA,片段等位基因由基因突变而来,若一对等位基因,A,、,a,经过限制酶切割后形成的,DNA,片段分子量不同,则在电场作用下移动距离不同,最终使得,A,、,a,得以分开,形成不同的条带。
专项突破,5,.(2024,辽宁辽阳模拟,),生菜的颜色受两对等位基因,A/a,和,B/b,控制野生生菜通常表现为红色,人工栽培的生菜品种均表现为绿色让某纯合野生型红色生菜植株与人工栽培的绿色生菜植株杂交,所得,F,1,再自交,F,2,中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为,9,7,育种工作者根据,A/a,和,B/b,的基因序列设计了特异性引物,并分别对,F,2,中编号为,18,的部分红色生菜植株的,DNA,进行扩增和分离,结果如图所示下列分析错误的是,(,),A.,杂交亲本的基因型是,AABB,和,aabb,B.,由植株,18,的,DNA,扩增和分离结果可知,F,2,红色生菜植株中基因,A/a,杂合的概率高于基因,B/b,的,C.,野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的,D.,植株,18,中的杂合子占,3/4,但杂合子的基因型不一定相同,答案,B,解析,F,1,自交,F,2,中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为,9,7,说明红色生菜基因型为,A_B_,F,1,基因型为,AaBb,由图可知,植株,3,、,5,的,A/a,、,B/b,的基因扩增结果都只有一条带,可知,3,、,5,为纯合子,杂交亲本的基因型为,AABB,和,aabb,时,满足亲本性状为红色和绿色,F,1,基因型为,AaBb,A,项正确,;,植株,18,个体数较少,其基因型存在偶然性,F,2,红色植株的基因型为,A_B_,A/a,基因杂合的概率等于,B/b,B,项错误,;F,2,中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为,9(A_B_),7,野生生菜通常表现为红色,因此野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的,C,项正确,;,植株,18,中,除,3,、,5,是纯合子外,其余均是杂合子,杂合子占,3/4,由图,DNA,扩增和分离的条带分布可知杂合子基因型不一定相同,D,项正确。