分子信标技术的研究与应用进展摘要本文对分子信标的原理、分类与应用分别进行了简介，并对分子信标的发展与应用前景 进行了展望关键词分子信标分子信标应用新型分子信标分子信标原理分子信标主要类型1. 引言随着人们对生命现象观察与探索的不断深入,从更微观更精确的角度诠释生命图景已成 为了科研人员的主要工作领域目前，这些工作已经深入到了纳米尺度、单细胞及单个分子 水平当后基因组时代的帷幕被拉开，基因组的结构及基因、全基因组表达调控的研究更成 为了当今生命科学研究的前沿因此，为了在这种研究尺度与领域卜•获取有价值且精确度高 的生物化学信息，我们必须对分析化学的各个领域提出新的要求也正因为这样，可进行实 时、原位、活体检测的分子探针应运而牛，逐渐成为了人们研究的热点与重点在各种分子 探针研究中，基于荧光共振能量转移原理而设计的荧光分子探针由于测量方便EL易于进行活 体检测而成为了研究中的重中之重现有的基于荧光能量转移的分子探针可分为以下三种类 型，即TaqMan探针、相邻探针与分子信标(Molecular Beacons, MBs)o分子信标是这三种 探件中设计得最为巧妙的一种，而这种设计也恰恰决定了它的多用途性。
基于分了信标的一 些独特的应用显示了分子信标在基因组学和蛋白质组学的实时分了识别等方面具冇很高的 灵敏度与特异性2. 分子信标简介Tyagi和Krame在1996年首次设计了一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针，这 种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发牛•构象的变化而发出荧光，并将其命名为分子信 标它具有独特的性质和多功能性，并有操作简单、灵敏度高、特界性强等优点，因此在短 短的几年内得到了迅速的发展，并已广泛地应川于实时监测聚合酶链式反应、基因突变的 快速分析、RNA与DNA的检测、DNA/RNA杂交的动力学研究以及DNA/蛋口质相互作川 研究等，而且在目前其应用领域仍在不断拓展分子信标是一个呈发夹结构的短链DNA,由茎与环两部分组成其环状部分一般是一 个长度在30个碱基左右的少靶分子互补的核酸序列；茎状部分的两臂是由序列互补的5〜7 个碱基对组成，并在5,和3,端分别连有荧光基团和荧光熄灭基团在分子信标与靶分子作 用之前，荧光基团与荧光熄灭基团互相紧靠，使得分子信标不能发出荧光；而当分子信标遇 到靶分了并与之结合时，环状部分会由于张力而打开，使分了信标的构想发生变化，并随之 发出荧光。
不仅如此，在高温、高pH、DNA损伤等条件下还会使分子信标的荧光信号增强由于分子信标易进行修饰和改性的特点，人们在经典分子信标模型的基础上，又设计出 了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA链代替ssDNA形成的PNA分子信标， 以及LNA分子信标等这些新型的分子信标的设计是为了满足不同程度研究的需要，它们 的特异性更强，稳定性更好，并促进了很多新的研究领域的发展而为了满足基因纽学与蛋 口质组学等高通量高灵敏度研究的需要，对分子信标的操作也从液相转移到固相上，固定化 的分子信标更方便操作，与基因芯片技术的结合使它的应用范围得到进一步的扩大3. 分子信标的主要类型与新型分子信标3.1分子信标主要类型3.1.1经典型分子信标经典型分子信标即为上述经典的茎坏分子信标模型,茎区的两端分别连接有荧光基团和 淬灭基团为了保证分子信标的灵敏度和热力学稳定性，在其茎干区设计的碱基数目一•般为 其环区的一半由于分了信标杂交前后环状区与II标分了的双链结构Z间存在热力学平衡关 系，使它的杂交特异性明显高于常规的线状探针两端的荧光基团和淬火基团一般是一-些有 机基团，荧光基团连接在信标分子的5,端，淬灭基团连接在3,端。
常用的荧光淬灭基团为 二甲基氨基偶氮苯甲fiJt(DABCYL),它对多种荧光素都有较强的荧光淬灭效率来,Dubertret 等用金纳米粒了簇代替DABCYL做淬灭剂，可以通过调节金纳米簇的形状、人小和组成而 得到不同的淬灭剂由于金纳米簇对荧光试剂冇着更高的淬灭效率，所以用金纳米粒了代替 DABCYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特界性其它的淬灭基团还有铜离子螯合物、 超分子淬灭剂以及直接利用碱基本身做淬灭剂等3.1.2无茎型分子信标与经典分子信标结构类似，无茎型分了信标只是不再含冇双链结构的茎杆区，只含冇单 链的环状结构，目前的无茎分子信标有PNA和DNA两种由于DNA戊糊骨架或PNA聚 酰胺骨架貝有很好的柔韧性，在无靶标存在的情况下，荧光分子与猝灭分子间的疏水作用使 得无茎分子信标近似于一个闭坏结构当分子信标与靶标结合后，探针和靶标形成的双链具 有刚性结构使荧光分了和猝灭分了分开，荧光恢复无茎分了信标与经典的分了信标和比, 其优点在于无茎分子信标不含与靶标无关的序列，在设计和合成上相对简单，另外还具有响 应快，特显性强等特点但缺点是口由状态时，无茎分子信标的荧光背景较高Kuhn等对 无茎DNA、无茎PNA和有茎DNA三种分子信标进行了比较研究，发现无茎DNA分子信 标由于高的背景信号而不能直接用于诊断，而无茎PNA能快速地与目标链结合，减少检测 时间，并且在复杂的体系中也能保持相对的稳定性。
Maxwell等将无茎分子信标与纳米技术相结合，这种分子信标的核心是一个2.5 nm 的金纳米粒子他将一端修饰有疏棊另一端修饰有荧光基团的分子信标通过Au-S键连接 到金上，rh于寡聚核苜酸链具冇很好的柔韧性，在自由状态时核苜酸更容易于形成一个环状 结构而且金纳米粒子乂具有较高的荧光淬灭效率在该分子信标与靶分子结合后，双链结 构的刚性增加迫使荧光基团离开金表而并发出荧光这种分子信标的背景荧光儿乎不受体系 温度等条件的影响由于纳米粒了具冇独特的结构和光学性质，这种生物传感器用作活体 MRI中的对照试剂和药物释放的载体或组织工程中的支架等另外，在纳米材料的合成、 多元生物分析和超灵敏光学检测中有很大的应用前景3.1.3固定化分子信标H. Du等将分了信标的一端用荧光基团标记，另一端用疏基标记，自组装到金膜表面, 肓接利用金膜木身的淬火性质，充当淬火剂后来，他们用金固相基质肓接取代了金膜来固 定化分子信标，同样取得了很好的结果用这种分子信标取代以往的线型DNA探针用于微 阵列技术，提高了这种技术的稳定性、特界性和灵帧度，又不用对其进行标记，可以极大地 节省时间和费用，述能减少分析过程中的谋差。
c. H. Fan等报道了-•种基于电化学性质的分子信标生物传感器，这种传感器是将一 个一端修饰有硫基，另一端修饰有电活性物质二茂铁的分子信标自组装到金表面在口由状 态时，二茂铁与金表面离得很近，电子能够在二茂铁和金表面自山传递，从而能够检测到电 化学信号杂交后，二丿戈铁被迫离开金表面，电信号也随之消失这种传感器可再主性能很 好，而「1.在检测过程中不需另加试剂，能够实现分析物的连续批量化检测，所需的仪器设备 也很简单，所以在现实中的实用性更强3.2新型分子信标在分了信标出现至今这短短的几年时间内，为了提高分了信标的选择性和灵敏度，降 低产牛假阳性信号的可能性，从而进一步扩人分子信标的应用领域，新型的分子信标不断涌 现出来在传统的发夹型的分子信标上进行改进而设计出来的新型分子信标具有一些显著的 优点目前，人们対于分子信标的改造主要集中在以下儿个方面：分子信标骨架的变化（如 DNA或PNA无茎分子信标）、荧光基团和猝灭基团的改变（如川核売量子点替代传统荧光 基团）、将分了信标与其它技术结合（如结合分了信标与TaqMan的特性合成一种TaqMan 型分了信标用于PCR扩增环境中）等随着分了信标技术的不断完善以及与其他技术的结 合，分子信标将在研究DNA-蛋白质相互作用等方面发挥重要作用，尤其是在研制高特界性 与灵敏度的基因或蛋白质芯片及传感器领域，会冇更大的应用潜力。
3.2.1荧光波长转移型分子信标Tyagi等发明了一种荧光波t转移型分子信标，即在分了信标的一末端连接两个不同的 荧光基团：荧光收集基团和荧光发射基团，分子信标的另一末端依然连接猝火基团未结合 靶分子时，它与传统的分子信标不产生荧光；当与靶分子结合发牛•构象变化后，荧光收集基 团的荧光并未恢复，而是把能量以荧光共振能量转移的形式转移给荧光发射基团，荧光发射 基团将能量以荧光的形式放出这样可以通过选择不同波长的荧光发射基团使得分了信标按 设计的要求发出不同颜色的荧光同时，这种新型的分子信标具有较大的Stocks位移，解 决了传统分子信标中激发波长和发射波长差别较小而影响灵敏度的问题而且，还可以通 过选择不同波长的荧光发射基团，实现多组分同时检测3.2.2双重荧光共振能量转移分子信标Zhang等设计了将两个荧光基团连接于发夹型分子两端的分子信标，一个荧光基团作为 能量给体，另一个荧光基团取代猝火基团作为能最受体，通过计算两个荧光基团荧光信号 之比的变化來反映被测物浓度这样的设计解决了传统分子信标中，荧光基团不能完全被 猝灭基团所猝灭而引起能量遗阳影响灵皱度这一难题这种计算荧光信号的比率的方法受光 源以及其他彫响光学测量的环境因素的影响较小，因此灵敏度较高，且对于要检测的靶分了 的浓度更加敏感。
3.2.3分子信标适体分子信标适休（Aptamer Beacon）也是刚发展起来的一种新型分子信标核酸适休是一 种通过指数级富集的配体系统进化（SELEX）技术而选择出来的与蛋口质等配体进行特界 结介的寡聚核酸序列，它可以与抗体相竞争，并冇望在医药研究及治疗学中得到广泛应用 分子信标适体将分子信标的荧光信号传导机制与核酸适体的蛋白质结合特异性相结合，通 过和蛋白质靶分子相互作用发牛•构象改变而产牛•荧光信号的变化以检测蛋白质4. 分子信标的应用聚合酶链反应（PCR）中首先使用分了信标作为荧光探针，它可以对扩增产物进行定量检 测，并可在扩增过程中进行实时的监测随着分子信标技术的不断发展，科研丁■作者们使分 子信标在各种研究领域中充分发挥出它的作用，目前分子信标不仅可以用于基因的定量、定 性检测，还可以用于对基因点突变等的分析上述新型分子信标PNA—DNA —坏模型还使 得检测双链DNA成为了可能而口分子信标技术还为研究DNA与蛋白质Z间的相互作用 捉供了一种简单、直接、灵敏、实时、可以用于活体检测的方法利用分了信标在分析、检 测核酸和蛋白质中的特点，分子信标还可以作为牛物芯片和牛物传感器的探针等。
4.1分子信标用于核酸的检测分析4.1.1分了信标用于活体内核酸的动态检测单分子水平上实现基因表达的实时监测，在基因组学、功能棊因组学和蛋白质组学中 具冇相当大的价值分了信标的出现，为活体细胞内的RNA和DNA的分析检测提供了途 径经典的分子信标由于易被核酸酶降解，造成假阳性信号，所以很难用于活体内的DNA 研究，但是通过对分子信标进行一定的修饰后，分子信标的稳定性增强，因此可以利用分子 信标技术可以对生物大分了在活体内的代谢等动态过程进行跟踪分析如Matsuo等人利用 分子信标研究mRNA在细胞内的代谢过程分别设计合成与待测日标mRNA序列互补的分 子信标和対照分子信标，并制成脂质体使之摄人细胞，然后用激光共聚焦显微镜或荧光显微 镜观察，实验结果表明：实验纽细胞的荧光明显高于对照纽细胞如果培养时间延长，对照 组细胞荧光会逐步增强，这是因为细胞内核酸酶会水解分了信标，使其结构遭到破坏而产生 荧光PNA分了信标可以很好地解决这一问题，PNA分了信标可以冇效地避免核酸酚的水 解，使荧光强度能准确反映活体mRNA的代谢4.1.2利用多色分子信标对多个靶核昔酸同吋定量检测选择不同的荧光分了或猝灭分了，可以设计出不同荧光的多个分了信标（又称多色分了 信标），每个分子信标与其各H的靶标序列杂交后，荧光检测系统可以检测到不同颜色的荧 光，这样多色分子信标可对多个靶。