《DNA的粗提取和鉴定》实验中的两个常见问题陶晓东（江苏省常州市武进高级中学生物组213161）摘要：中学实验中提取DNA的实验材料的选择问题，几种实验材料各 自的优缺点；DNA鉴定过程中易出现的一些常见问题及具体的 解决方案关键词：鸡血细胞DNA提取液 二苯胺试剂人教版高中生物教材第二册（必修）中的实验十一《DNA的粗提取和鉴定》 是一个比较重要的学生实验该实验比较复杂，在实际操作过程中需要注意的 细节问题也非常多，而且往往因为某个环节的操作不当，结果不能观察到明显 的实验现象因此，冇必要对实验过程中应当注意的问题做一些探讨从我个 人和学生的实际实验操作过程中，我认为有以下两个问题值得注意一、 实验材料的选择问题：虽然各种生物细胞中都含冇大量的DNA,但是并不是每一种生物组织都适 合做提取DNA的原材料比较好的实验材料最好应该满足以下几个条件1. 组织中DNA的含量比较丰富,能够适合大量提取2. 该组织中所含化合物种类应比较单纯，避免出于其他物质化学性质与 DNA相近，从而对实验现象产生某些干扰3. 实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本4. 实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单的条件下能大量 提取ill DNA,便于学生实验操作。
可用于提取DNA的实验材料很多，人教版高中生物第二册教师教学用书 中提供了两类可用于提取DNA的实验材料：鸡血和植物组织（新鲜菜花、蒜 黄、菠菜等）；另外在《实验教学与仪器》杂志2002年第一期的《探讨“DNA 的粗提取与鉴定”的实验改进》一文中提供了另一种可行的实验材料：鱼类的 精巢；此外，在高教出版社《生化实验方法和技术》一书中还介绍了一种从动 物胸腺中提取DNA的方法，这是一种大学教材上提供的方法这几种实验材 料由于各口性质的差异，实验的操作过程和步骤有很大的差别，以下是四种实 验材料特点的粗略比较实验成本DNA含特殊药品实验仪器实验效果 量配置配置鸡血细胞取材易，价格 较低丰富柠檬酸钠离心机可操作性强，实验 效果明显植物组织易取材，价格 较低较丰富SDSEDTA三轻甲基氨基甲烷常规实验成功率较低， 实验效果•研磨 液关系密切，尙类粘:巢取材易，价格 较低丰富无组织捣碎机可操作性强，效呆 明显，但不易定量 控制动物胸腺収材不易，价格高丰富柠檬酸钠离心机 组织捣碎机可操作性较强，适 宜做定量分析注：SDS：十二烷基磺酸钠 EDTA：乙二胺四乙酸二钠根据以上对比可以看出，如果从取材方面來考虑的话,以动物胸腺组织作为 实验材料是不经济的，而II还要面临中学实验条件的限制等问题。
我没有具体完 成过该实验，如果有兴趣的话，该实验的实验方法可查阅相关资料使用其余三种物质作为实验材料，学生的操作过程大同小异，具体数据可 能会有一定的差别，以下是三种不同方法步骤的比较鸡血细胞植物组织鱼类精巢1.配质量浓度为O」g/ml的柠檬酸钠溶 液，按1:2的比例与新鲜鸡血混合搅拌 均匀2 •将血液倒入离心管中，在1000r/min的转速下离心2〜3分钟,弃上部澄清液3 •取离心管底部的血细胞液约5〜10ml加入到100ml烧杯中，向烧杯中加入 20ml蒸谓水，用玻棒沿一个方向快速 搅拌5分钟，加速血细胞在低渗溶液 中的破裂4 •将10%的氯化钠溶液50ml缓缓倒入烧杯中，用玻棒沿一个方向搅拌，此 吋DNA溶解于氯化钠溶液中，滤除 杂质，获得粘稠状的鸡血细胞DNA 提取液5 •将鸡血细胞DNA提取液置于较大的烧杯中，沿烧杯内壁缓缓倒入蒸憾水，1.取新鲜植物组 织（菜花）放置 于冰箱中冷却 1~2天2 •取30克植物组 织，切碎，置于研 体中，倒入10ml 研磨液，充分研 磨10分钟3. 将研磨液置于 离心管中，在 1000r/min 的转 速下离心2~3 分钟，取上清夜 置于冰箱中冷 却几分钟4. 取1倍体积的1・取成年雄性 鲫鱼1条，取出 精巢10克，用组 织捣碎机捣碎成 糜2・组织糜溶于 500ml 10%NaCL 溶液中，用玻璃 棒搅拌至凝胶状 3・取部分凝胶 状的DNA捉取 液进行DNA的 提纯，提纯DNA 的实验过程同以 鸡血为实验材料 的实验操作步骤 6〜7,具体数拯有上清液，加入2 倍体积的95% 的冷酒精当中， 用玻棒轻轻搅 拌，沉淀3〜5 分钟后可见白 色絮状DNA缠 绕于玻棒末端。
5 . DNA的提纯同 鸡血细胞为实 验材料的实验 操作步骤6、7, 具体数据有一 定的差异6.鉴定（略）一定的并异4 .鉴定（略）并不断搅拌，直到粘稠状DNA不再 析出为止用玻棒搅拌，使析出的 DNA缠绕于玻棒末端为减少DNA 的损失，可省略教材上耍求的用纱布 过滤这一步骤6 •将析出的DNA再溶解于20ml 10%的氯化钠溶液中7 .在DNA的氯化钠溶液中倒入95%的酒精50 ml（冷却过的酒精效果较好）, 使DNA再次析出，用玻棒搅拌，使 DNA再次缠绕于玻棒末端8.DNA的鉴定：取两支试管，各加入 2mll0%氯化钠溶液，将DNA溶解于 其中一支试管中，另一支做为对照组 然后，在两支试管内加入相同的量的 二苯胺试剂，水浴加热lOmin左右， 冷却，观察实验现象从实验的效果來看，使用鱼类的精巢与使用鸡血细胞没有太人的区别，如 果考虑实验成木的话，两者存在一定的差别如果使用鸡血细胞作为实验材料, 鸡血细胞DNA提取液的储备一定耍充足，一•般来说，每组学生（2人）需要使用至少5ml鸡血细胞DNA提取液，一个60人的班级则至少需要150毫升鸡血 细胞DNA提取液，而鸡血细胞DNA提取液与鸡血体积比约为5： 1,宰杀一 只中等犬小的活鸡可以获取100毫升左右的鸡血，可制备约500毫升鸡血细胞 DNA提取液。
口J以供3个班级使用，实验成本尚可（根据具体的实验结果，在 此我提供的实验数据与教学参考书上有区别）相对于鸡血，如果使用鱼类精 巢做实验材料的话，一条普通的鲤鱼的精巢约重30〜40克，大约可以制备粘稠状的DNA提取液2000毫升左右，每个学生-•般只需要使用5ml左右的凝胶状 的DNA提取液，这样一条鲤血的精巢可以作为至少12个班级的实验材料，可 人人降低实验成木但是从实验准备的角度来看，使用鸡血细胞作为实验材料 的操作就比较简便了，用鱼类精巢虽然可以省略离心等实验准备工作，但如果 没有组织捣碎机的话，制备DNA粗提取液是一件相当费事的事植物组织作为实验材料，实验的效果并不理想，为了避免植物细胞中一些 物质的干扰，需要在研磨液中须加入SDS作为蛋白质的变性剂，加入EDTA作 为DNA酶的抑制剂，并依靠三轻甲基氨基甲烷/HCL缓冲体系维持DNA的稳定在研濟过程中，往往会产生大量的气泡，而实际能获得的含冇DNA的研 磨液极少，而离心后得到的上清液会更少另外，由于植物组织中DNA的含 量相对较少，实验效果也会差许多从以上实验步骤的对比可以看出，从实验准备的角度来看，使用鱼类精巢 作为实验材料成本最低，由于鱼类精巢中DNA的含量极为丰富,且精巢细胞内 其他生物活性物质较少，在做DNA的鉴定时能够避免其他物质的干扰，因此, 我认为，如果只要求一个定性的实验结果的话，无疑，鱼类精巢是一种比较好的 实验材料。
如果无须精打细算且希槊能尽量简化实验准备工作，鸡血细胞是一 个很好的选择具体采用哪种实验材料可酌情选择二、 DNA的鉴定过程中的若干问题1、 二苯胺的性质：二苯胺是一种非极性芳香族有机分子，熔点比水低, 微溶解于水，易溶解于酒精、冰乙酸等有机溶剂化学性质活泼， 遇光易变色因此要放置于暗处保存二苯胺有毒2、 二苯胺试剂的配制：A液:1.5克二苯胺溶解于100ml冰乙酸中，在 加入1.5ml浓硫酸（此处浓硫酸的作用可能是作为强氧化剂来维持试 剂的稳定），配制好的A液保存在棕色瓶中B液：休积分数为0.2% 的乙醛由于乙醛是一种还原性试剂，所以实验前不能将A液和B 液混合在一起同时因为二苯胺试剂性质不稳定，极易变色，因此 建议现配现用3、 二苯胺试剂鉴定DNA的原理：DNA分子中的脱氧核糖在酸性环境 下生成3 ■疑基・丫 ■酮基戊醛，再与二苯胺试剂结合显蓝色，颜色的 深浅与溶液中的DNA含量成正比4、 鉴定实验的一些问题：在学生实际的实验过程中，在水浴后15分钟 内岀现明显实验现彖的比例往往非常低，经常会出现整个班级没冇 明显鉴定结果的现象根据实际操作的结果，我认为很可能取决于 以下儿个因素：⑴在试管中加入一定量10%氯化钠溶液,然后再将捉取出来的DNA 溶解于其中，在实验过程中，经常会出现缠绕于玻璃棒末端的DNA 的量过少的情况,如果溶解于氯化钠溶液中的DNA的量过少的话,与过量的二苯胺试剂共热时，出现的蓝色会比较浅。
⑵加入二苯胺试剂时，首先观察二苯胺试剂A的颜色新配的二苯 胺试剂A呈无色，而如果放置一段时间之后，逐渐呈现浅绿色， 放置几天Z后，变为蓝色，如果使用该变色后的试剂，对实验结果 有很大影响因此，实验应使用新配制试剂，同时使配制好的试剂 尽量避免受到强光照射实验时，可先将试剂A滴加入溶有DNA 的氯化钠溶液的试管后，再滴加几滴试剂B,震荡均匀（试剂A 与试剂B不要事先混合）⑶滴加入一定量的二苯胺试剂并震荡后，溶液会呈现口色浑浊（二 苯胺遇水后大量析岀），水浴加热后，白色浑浊可能会消失，由于 二苯胺的熔点较低，最初我认为很有可能是析出的二苯胺转化为液 态油滴的缘故经多次实验，我发现白色浑浊的消失与否实际上和 加入的二苯胺试剂的量的多少冇关当二苯胺试剂加入较多时，整 个混合溶液体系中的醋酸浓度会相应的增大，由于二苯胺能很好的 溶解与醋酸中，因此口色浑浊消失也就不足为怪了具体的实验结 果可参见下而的表格⑷水浴加热5〜10分钟后，撤去酒精灯，使试管冷却，静置一段时 间后，试管中溶液变为蓝色在实际操作过程中，我发现如果没有 将试管及时冷却的话，多数情况下试管内的物质不会变色而水浴 一段时间后静置冷却，试管内会或深或浅的呈现岀蓝色。
因此加热 后建议冷却一段时间冷却后不同试管内溶液变色的时间可能会有 差异，冇的可能会立刻变色，冇的则几天Z后才慢慢变色下面的表格表示了不同情况下DNA鉴定结果出现的差异（为定量表示 DNA含量与实验现彖的关系，本实验以鸡血细胞作为实验的材料，以鸡血 细胞DNA捉取液的量来表示DNA的量，所冇的对照组中粗捉取出的DNA均溶解于2mll0%氯化钠溶液中）①加入二苯胺试剂A2M :加入二苯胺试剂A后试管中岀现口色浑浊，水浴吋间约10〜15分钟<1小时>1天、/、/V②加入二苯胺试剂A4M :加入二苯胺试剂A后试管中出现白色浑浊，水浴加热白色浑浊部分消失血细胞DNA提、^液（ML）出现蓝色 时间 、\246约10〜15分钟<1小时VVV>1天③ 加入二苯胺试剂A6ml :加入二苯胺试剂A后试管中出现口色浑浊，震荡后白色浑浊即可消失血细胞DNA提、^液（ML） 出现蓝色矗\ 吋间246约10〜15分钟<1小时>1天综合以上实验的分析结果，二苯胺试剂A与鸡血细胞DNA提取液的定量 比并不是影响实验效果的关键因素，当二苯胺试剂A量比较大时，整个溶液体 系中遇水析岀的二苯胺的量比较小，此时，实验的效果比较明显，有时甚至还 在水浴加热时（无须冷却）就可。