第二章 生物制品的制备（Preparation）第一节 一般生物制品的制备方法 (Preparation of general bio-preparate ) 一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （Selection、pretreatment and preservation of raw material of biopreparate）,（1）原料选择原料的选择原则： ①有效成分含量高，新鲜；②原料来源丰富，产地较近；③原料中杂质含量少；④原料成本低等原料的选择注意事项：①植物原料生长的季节性；②微生物原料的对数期；③动物原料的年龄与性别2）原料的预处理与保存： ①动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存 ②植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理； ③微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理原料的保存方法主要有： ①冷冻法该方法适用于所有生物原料常用-40℃速冻 ②有机溶剂脱水法常用的有机溶剂是丙酮该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等 ③防腐剂保鲜常用乙醇、苯酚等该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。
二、生物制品的提取（extraction）(1)生物组织与细胞的破碎（obtrude of tissue and cell）：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的常用的破碎方法： ①磨切法，该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等 ②压力法，有加压、减压、渗透压三种,③反复冻融法，设备简便，活性保持好，但用时较长 ④超声波振荡破碎法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失 ⑤自溶法或酶解法，用得较少2）提取（extraction）生物组织与细胞破碎后要立即进行提取提取时，首先要根据活性物质的性质，①选择提取试剂提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间③注意提取的温度、pH、变性剂等因素三、蛋白质类制品的分离纯化方法（Isolation and depuration of protein production） 包括蛋白质、多肽和酶类等药物分离纯化方法有： (1)沉淀法（precipitation）：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。
原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质常用的有盐析法（salting out）、有机溶剂沉淀法（organic solvent precipitation）、等电点沉淀法（isoelectric precipitation）、与靶物质结合沉淀法（如抗体—抗原）（target banding precipitation）等蛋白质,,中性盐,中和电荷 水化层减弱,,溶解度下降，沉淀,盐析法原理,等电点沉淀法,在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物2) 按分子大小分离的方法：有超滤法（ultrafiltration）和透折法（dialysis）（即膜分离方法）、凝胶层析法（gel chromatography）、超速离心法（ultra centrifugation转速大于20 000r/min）等其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同 ，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。
凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快这种现象称为分子筛效应3)按分子所带电荷进行分离的方法 氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质它们具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷例如某蛋白质等电点为7.0，当溶液pH为4.0时，分子则带有正电荷由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法利用电学性质进行分离的方法有离子交换柱层析法（ion-exchange chromatography）、电泳法（electrophoresis）、等电聚焦法（isoelectric focusing）等4）亲和层析法（affinity chromatography） 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析 亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一亲和色谱（affinity chromatography）1）基本概念（basic concept） 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。
配基（ligand） ：被固定在基质上的分子称为配基，配基和基质是以共价键结合的 基质（matrix）：亦称为载体（vector），是构成固定相的骨架 2）亲和层析有如下特点（Characteristics of Affinity Chromatography）,纯化过程简单、迅速； 分离效率高； 产物纯度高； 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制3）亲和层析的基本原理 （Mechanism of Affinity Chromatography） ①亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂 ②当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 ③然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来见Fig1、Fig2） Fig1. Mechanism of AC）,,（Fig2. Mechanism of AC）,抗原,专一抗体,基质,,,具有特异性亲和作用的生物分子 4）配基的种类 (sorts of ligand) 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)。
酶与其底物 激素与其受体 维生素与结合蛋白 糖蛋白与植物凝集素5）亲和层析载体的性质与选择 亲和层析载体的选择（selection of vectors） 多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过 颗粒均匀，具有良好的流速 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 在温和的条件下 能与配基共价偶联6）常用的亲和层析载体（Vectors of Affinity Chromatography） 纤维素（cellulose） 葡聚糖凝胶（Sephadex） 琼脂糖凝胶（Sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel） 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它新型载体（Other gels）,7）亲和层析配基的选择（Selection of ligand） 1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 2.但亲和力太高也是有害的，因为在解离配 基复合物时所 需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 3.配基必须具有适当的化学基团，可用于和 载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力8）载体、配基、目的物的连接 （Conjunction of vector、ligand and target material）,载体（Vectors or Matrix）+配基（Ligand）+目的物（target material）,Fig AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.,Fig Spacer arm principle,,A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.,Fig Principle of preparing AC media,9）亲和层析的基本操作方法：,①平衡（ Equilibration）用平衡Buffer冲洗柱体，至基线平稳.,②样品上柱和冲洗 （Sample application and wash）样品中的目的物与层析介质选择性的吸附，杂质不被吸附。
用上样Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来形成杂质峰（见下图）③洗脱（Elution） 选择适当的条件，将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来（见下图）四、核酸类制品的分离纯化方法 （Isolation and depuration of nucleic acid ） 核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法提取法生产DNA和RNA，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA发酵法主要用于生产单核苷酸高RNA含量酵母,,摇瓶发酵,种子培养物,,连续发酵,发酵液,,过滤,酵母菌体,,NaOH 20℃搅拌,破壁,,氨水处理,,离心,上清液,,沉淀蛋白,,三氯乙酸,,酸调pH,核酸粗品,,乙醇洗涤,干燥,RNA干品,五、糖类制品的分离纯化方法 （ Isolation and depuration of sugar ）由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法1）提取方法 （extraction）非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液降解法（degradation）适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖（mucoitin）。
如从软骨中分离提取硫酸软骨素（chondroitin sulfate），就是用碱处理进行降解又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖2）分离方法 （isolation）常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法 乙醇沉淀法（alcohol precipitation）：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀用季铵化合物也可沉淀粘多糖粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（CTA）等离子交换层析法（ion exchange chromatagraphy)：粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如Dowex I-X2（商品名）离子交换树脂、DEAE-离子交换纤维素（二乙胺乙基）等洗脱可用NaC1溶液进行梯度洗脱六、脂类制品的分离纯化方法 （isolation and depuration of lipoid） （1）提取方法（extraction ）脂类自然状态下是以结合形式存在的非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。
常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等2）纯化方法（depuration） 沉淀法(precipitation) ：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀 吸附层析法(adsorption chromatography)：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出离子交换层析法（Ion exchange chromatography） : 脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态根据它们在一定pH条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯如TEAE—纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。