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细胞培养基种类与基本成分

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细 胞 培 养 基 种 类 与 基 本 成 分培养基种类经典的培养基有很多种,其中 DMEM 、 RPMI?1640、 MEM 、 DMEM/F12 都是应用最广泛的培养基其他 如 M199 、 IMDM 、 L15 培养基等也用于某些细胞的培养其具体的特征及应用如下:1、 BME 细胞培养基基础 Eagle 培养基( Basal?Medium?Eagle), 1955 年 Eagle 设计, BSS+12 种氨基酸+谷氨酰胺+ 8 种维生素简单、便于添加,适于各种传代细胞系和特殊研究用,在此基础上改良的细胞培养基品种有 MEM 、 DMEM 、IMDM 等2、 MEM 细胞培养基又称低限量 Eagle 培养基(Minimal?Essential?Medium),1959 年在 Eagle's基础培养基(BME )上修改而来,删去赖氨酸、生物素,氨基酸浓度增加,适合多种细胞单层生长,有可高压灭菌品种,是一种最基本、试用范围最广的培养基,但因其营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基3、 DMEM 细胞培养基DMEM 是由 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基,起初是为小鼠成纤维细胞设计的。

DMEM 的氨基酸浓度是 MEM 的两倍,维生素浓度是 MEM 的 4 倍,采用双倍的 HCO3-和 CO2 浓度起到更好的缓冲作用最初的配方中葡萄糖含量为 1000?mg/L,后来为了某些细胞的生长需要,将葡萄糖含量又调整为 4500?mg/L,这就是大家常说的低糖和高糖了低糖适于依赖性贴壁细胞培养,特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养高糖更适合高密度悬浮细胞培养,也适用于附着性较差,但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养,也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和 DNA 转染的转化细胞的培养 例如 CHO 细胞表达生产乙肝疫苗、 CHO 细胞表达 EPO4、 IMDM 细胞培养基Guilber?和 Iscove 将 Dulbecco'?Medium?改良为 ?Iscove's?Medium,用于培养红细胞和巨噬细胞前体此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和 HEPES并用硝酸钾取代了硝酸铁 IMDM 还能够促进小鼠 B 淋巴细胞, LPS 刺激的 B 细胞,骨髓造血细胞,T 细胞和淋巴瘤细胞的生长 IMDM 为营养非常丰富的培养液,因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。

5、 RPMI-1640 细胞培养基Moore 等人于 1967 年在 Roswell?Park?Memorial?Institute 研制,针对淋巴细胞培养设计,含 BSS+21 种氨基酸+维生素 11 种等现也用于悬浮细胞培养,如哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞, 杂交瘤细胞的培养, 其它像 K-562、HL-60 、Jurkat、Daudi、 IM-9 等成淋巴细胞、 T 细胞淋巴瘤细胞以及 HCT-15 上皮细胞等均可参考使用6、 HamF10 细胞培养基1963 年 Ham 设计,含微量元素,可在血清含量低时用,适用于克隆化培养F10适用于仓鼠、人二倍体细胞,特适于羊水细胞培养7、 DMEM/F12细胞培养基Ham's?F12是为在低血清浓度下克隆 CHO 细胞而设计的,现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养 F12 还可以与 DMEM 等体积混合使用, 得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物,这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养由于营养成分丰富,且可以使用较少血清,故也常作为无血清培养基的基础培养基8、 M199 细胞培养基1950 年 Morgan 等设计的具有确定化学成分的细胞培养液,即 M-199 。

除BSS 外,含有53种成分,为全面培养基,主要用于鸡胚成纤维细胞培养此培养液必须辅以血清才能支持长期培养 M-199 可用于培养多种种属来源的细胞,并能培养转染的细胞现广泛用于病毒学、疫苗生产9、 McCoy5A 培养基1959 年 MeCoy 为肉瘤细胞设计, BSS+ 40 种成分可支持多种(如骨髓、皮肤、肺和脾脏等)的原代移植物的生长,除适于一般的原代细胞培养外,主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持例如 Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、 HT-29 、BHL-100 等上皮细胞10、L15 细胞培养基L-15 培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养,用于在 CO2 缺乏的情况下培养肿瘤细胞株此培养液采用磷酸盐缓冲体系,氨基酸组成进一步改良,并由半乳糖替代了葡萄糖培养基成分细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便1、合成培养基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质:氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位。

不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸, 在缺少谷氨酰胺时, 细胞生长不良而死亡 因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺 但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定, 应置于 -20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内已含谷氨酰胺的培养液在 4℃冰箱中储存 2 周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡 此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能培养液的渗透压是一个非常重要的因素 , 细胞通常可耐受260mOsm/kg ~ 320 mOsm/kg标准培养液的渗透压在此范围内波动特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质向培养液中添加 HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度缓冲系统大多数细胞所需 pH 在 7.2 - 7.4 但是,细胞培养最适 pH 值随培养的细胞种类不同而不同。

成纤维细胞喜欢较高 pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)由于多数培养液靠碳酸氢钠( NaHCO3)与 CO2 体系进行缓冲,因此,气相中的 CO2 浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡 如果气相或培养箱空气中 CO2 浓度设定在 5%,培养液中 NaHCO3 的加入量为 1.97g/L;如果 CO2 浓度维持在 10%,培养液中 NaHCO3 的加入量为 3.95g/L细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换 HEPES 是一种非离子缓冲液,在 pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力, 但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒 HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用,以抵消因额外加入 HEPES 引起的渗透压增加在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中大多数培养液中含有酚红作为 pH 指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色维生素在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源, 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长其它成分在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。

如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇( 2-Mercaptoethanol,2-Me) 2-Me 对细胞生长有很重要的作用有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用2-Me的活性部分是硫氢基,其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用同时避免过氧化物对培养细胞的损害另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成,增加植物凝集素 (PHA) 对淋巴细胞的转化作用,已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞2-Me 是一种小分子还原剂,极易氧化分子量为78.13,纯的 2-Me 是一种无色有刺激味的液体,比重为1.110-1.120(Do20),常用终浓度为5×10-5M常配制成 0.1M 的储存液,用时每升培养液加 0.5ml液体培养基保存:液体培养基应于 4℃冰箱避光保存,实验前放入 37℃预热未加血清液体培养基有效期为 12 个月液体培养基中的 L- 谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解如果细胞生长不良,可以再添加适量 L- 谷氨酰胺干粉培养基保存:4℃冰箱避光保存,有效期 36 个月。

血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清是最常用的血清,分为胎牛血清和新生小牛血清胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格昂贵新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清, 如厂家能做到这一点,新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质,其质量明显不如前两种血清的质量,种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长,而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同,尤其是对克隆细胞的生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质因此,在购买大量血清之前,必须对血清支持细胞生长能力进行检测,然后再大量购买质量好的同一批号的血清,并注意以下几点:(1)需要长期保存的血清必须储存于 -20℃ –70℃ 低温冰箱中 4℃冰箱中保存时间切勿超过 1 个月由于血清结冰时体积会增加约 10%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂2)一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清3)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法: -20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入 4℃冰箱中溶解 1 天。

然后移入室温,待全部溶解后再分装在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡) ,使温度与成分均一, 减少沉淀的发生 切勿直接将血清从 -20℃进入 37℃ 解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀4)热灭活是指 56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清加热过程中须规则摇晃均匀此热处理的目的是使血清中的补体成分( complement)灭活除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显着增多,而且还会影响血清的质量补体参与反应有:细胞毒作用 , 平滑肌细胞收缩 , 肥大细胞和血小板释放组胺。

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