和江苏省水生动物气单胞菌分离鉴定及耐药分析 吴亚锋 王楠楠 王晶晶 方苹 姚俊宇 刘肖汉摘要：为调查江苏省水生动物感染气单胞菌（Aeromonas）的流行规律和发病特征，本研究于2017年和2018年在全省范围内采集鱼、虾、蟹等发病样品1 375批次，并进行细菌分离鉴定和体外药敏试验结果表明，共分离得到气单胞菌1 364株，其中以嗜水气单胞菌最多，占67.23%最小抑菌浓度（MIC）试验结果表明，气单胞菌分离株对8种抗菌素均表现出不同程度的耐药性，其中喹诺酮类药物、氟苯尼考对分离株的MIC最低，均为0.39 μg/mL从耐药性角度分析，气单胞菌分离株对恩诺沙星的耐药率最低，为8.58%与2017年相比，2018年气单胞菌分离株对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸环丙沙星、盐酸土霉素等6种抗菌素的耐药率均有所提高综上，作为治疗水生动物细菌性疾病的常用药物，恩诺沙星和氟苯尼考目前仍有良好的效果，但须要警惕细菌耐药性的进一步提高关键词：江苏省;水生动物;气单胞菌;分离鉴定;抗菌素;耐药性： S941.42 文献标志码： A ：1002-1302（2020）24-0156-07气单胞菌（Aeromonas）广泛分布于池塘、水库等不同的水体环境中[1-2]，在健康人体和鱼类体内也有分布[3]，为条件致病菌，在应激条件（如饲料不佳、溶解氧含量较低、气候剧变等）下，能引起大宗淡水鱼、虾蟹类等水生动物发生细菌性出血性败血症[4]，造成巨大的经济损失。
近年来，因为一直无法真正做到有针对性地科学用药，在生产实践中则反映出在疾病防治过程中的乱用、滥用药物现象比较普遍，极易产生耐药菌株，加剧了气单胞菌感染的防治难度[5]据统计，2017年江苏省水产养殖面积为 4.21万hm2，水产品养殖产量为520.1万t，渔业产值为1 730亿元，占农业经济总产值的22.51%2018年江苏省渔业经济总产值达到3 386亿元，同比增长5.1%，水产养殖在农业中的地位和作用凸显[6-7]江苏省2017年因水产病害造成的直接经济损失高达47 312万元，其中细菌性疾病发生比率占50.51%为进一步提高水产养殖业的经济产值和指导养殖户科学用药，十分有必要进行细菌性疾病的监测工作为探究江苏省水生动物气单胞菌感染的流行规律及发病特征，本研究于2017年、2018年采集了江苏省主要水产养殖区常见养殖品种样品，分离鉴定得到气单胞菌，并进行药物感受性分析，以监测其变化趋势，同时绘制分离株对常见药物的耐药谱，以期为指导养殖户规范用药提供一定的科学依据1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 样本采集 根据江苏省各地水產养殖业发展情况和养殖规模，于2017年、2018年采集水生动物发病样品。
样本采集地区信息见表1样品来源涵盖大宗淡水鱼类如青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等，特色养殖品种如凡纳滨对虾、暗纹东方鲀、克氏原螯虾、中华绒螯蟹、脊尾白虾等采样部位包括肝、脾、肾、鳃、腹水等1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒、DL2000 DNA marker、核酸染料、琼脂糖、琼脂粉等，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;2PCR Mix液，购自宝生物工程（大连）有限公司;脑心浸液肉汤（BHI），购自英国Oxoid公司;革兰氏染色液、细菌生化微量鉴定管，均购自杭州天和微生物试剂有限公司;硫酸新霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、甲砜霉素、盐酸环丙沙星、红霉素、盐酸土霉素和盐酸多西环素等8种抗菌素药物标准品均购自南京鼎国生物技术有限公司其他相关试剂均购自国药集团上海化学试剂有限公司1.2 试验方法1.2.1 菌株分离纯化、革兰氏染色和生化鉴定 气单胞菌的分离纯化按照曹青等的方法[8]进行，革兰氏染色及各项生化指标的检测和结果判定参照文献[9]进行1.2.2 16S rRNA和gyrB基因PCR扩增及序列分析 采用16S rRNA和气单胞菌属看家基因DNA促旋酶B亚单位合成基因（gyrB）进行分子生物学鉴定，引物序列见表2。
细菌基因组的DNA提取、PCR扩增和序列分析按照曹青等的方法[8]进行，菌株系统发育树用MEGA 5进行制作1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）测定 根据陈昌福等依据日本化学疗法学会改良的方法[10]进行细菌最小抑菌浓度的测定和判读根据美国国家临床实验室标准委员会（clinical and laboratory standards institute，简称CLSI）颁布的判断标准和赵姝等的方法[11]，进行药物的敏感性结果判定判定标准如表3所示，并以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株2 结果与分析2.1 气单胞菌分离鉴定结果在BHI固体培养基上，气单胞菌分离株的菌落呈圆形、中央微凸、表面光滑、淡黄色，镜检为革兰氏阴性短杆菌部分气单胞菌生化试验结果见表4，对分离菌进行16S rRNA扩增，将条带大小跟预期目的条带大小一致（图1-A）的PCR产物送样测序，利用Blast比对确定到种确定为气单胞菌的菌株，再进行gyrB基因PCR检测，将条带大小为 1 100 bp 的样品（图1-B）进行测序分析和遗传演化分析（图2）2.2 气单胞菌分离株种类及组成2017年和2018年从发病水产样品中共分离得到气单胞菌1 364株，涉及11个种（表5），其中嗜水气单胞菌占大多数，为67.23%，在全省主要水产养殖地区都能分离到;其次是维氏气单胞菌和温和气单胞菌，分别占17.45%、12.02%;此外还分离到A. culicicola、舒氏气单胞菌和异嗜糖气单胞菌等属内不常见菌种，表明气单胞菌在江苏省水生环境中分布广泛且种类较多。
2.3 菌株来源情况对气单胞菌分离株来源情况进行分析，由表6可知，鲫源株最多，占38.56%，其次为草鱼源和中华绒螯蟹源分离株，分别占22.36%、11.58%从以青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊为主的大宗淡水鱼中共分离到各种气单胞菌1 018株，占总数的74.63%2.4 气单胞菌分离株对抗菌药物的感受性2.4.1 抗菌药物对气单胞菌分离株的MIC 2017年、2018年共分离得到气单胞菌属细菌1 364株，抗菌药物对其的MIC如表7所示喹诺酮类药物、氟苯尼考对气单胞菌分离株的MIC最低，均为 0.39 μg/mL，其次为硫酸新霉素、盐酸土霉素、盐酸多西环素;红霉素对气单胞菌分离株的MIC最高，为50.00 μg/mL2.4.2 气单胞菌对抗菌药物感受性的变化 根据抗菌药物对气单胞菌分离株的MIC，判定菌株对不同药物的感受性如图3所示，气单胞菌分离株对恩诺沙星的耐药率最低，为8.58%，其次为盐酸多西环素;除红霉素外，分离株对甲砜霉素的耐药率最高，为29.84%与2017年相比（表8），2018年分离的气单胞菌分离株对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸环丙沙星、盐酸土霉素等6种抗菌素的耐药率都有所提高，最高提高了17.91%，最低提高1.56%;而对恩诺沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸环丙沙星、盐酸土霉素等5种抗菌素的敏感率下降，其中对氟苯尼考的敏感率下降了10.63%。
2.4.3 抗菌药物对不同种气单胞菌分离株的MIC 对抗菌药物对不同种气单胞菌分离株的MIC进行比较如表9所示，8种抗菌素对维氏气单胞菌的MIC均不低于对嗜水气单胞菌和其他几种气单胞菌的MIC，其中恩诺沙星、盐酸环丙沙星對它的MIC均为嗜水气单胞菌的7.8倍;而8种抗菌素对嗜水气单胞菌的MIC均为最低值，但与温和气单胞菌的相差不大这表明维氏气单胞菌在气单胞菌属中耐药性较强，具有潜在的威胁，也与近期维氏气单胞菌引起发病的报道越来越多有一定相关性[12]2.5 不同地区鲫源气单胞菌分离株对恩诺沙星和氟苯尼考的感受性恩诺沙星和氟苯尼考在江苏水产养殖上使用较多为探究地域差异对恩诺沙星和氟苯尼考耐药性的影响，以样本量较大的鲫为研究对象，比较江苏省13个地级市鲫源气单胞菌分离株对这2种抗菌素的耐药性由图4可知，扬州地区气单胞菌分离株对恩诺沙星的耐药率远远高于其他地级市，达到62.5%;其次是徐州市，为25.0%;宿迁、南通、无锡、南京、苏州、 连云港等市的最低，均为0南京和镇江地区气单胞菌分离株对氟苯尼考的耐药率较高，分别为74.19%、71.43%;其次为徐州市，为50.0%;无锡、苏州、扬州、淮安、连云港等市的最低，均为0。
鉴于某些地级市鲫源气单胞菌菌株数略少，地区耐药性趋势的准确性还有待持续监测扬州地区气单胞菌分离株对恩诺沙星最耐药，但对氟苯尼考较敏感;而南京地区气单胞菌分离株对氟苯尼考较耐药，但对恩诺沙星较敏感这表明不同地区的养殖用药习惯对病原菌分离株的耐药性有较大影响3 讨论气单胞菌在江苏省水生环境中分布广泛且种类较多，本研究在江苏省各地采集样本1 375批次，分离得到气单胞菌1 364株丁正锋等对江苏省水产养殖主要病原菌开展监测工作，通过生化鉴定、分子生物学鉴定和高通量测序等方法，均发现在发病样品分离菌中以气单胞菌属细菌最多[13-15]本研究共鉴定出11种气单胞菌，其中嗜水气单胞菌在江苏省主要养殖区的水生环境中最常分离到，占总数的67.23%，其次是维氏气单胞菌，这与Figueras等的研究结果[3，16]一致崔丙健等发现嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和维氏气单胞菌三者的丰度相差不大[15];而Ghenghesh等则认为在水生环境中温和气单胞菌在气单胞菌中占很大的比例[17];Li等检测了闽江流域中气单胞菌的分布，发现豚鼠气单胞菌和水族箱气单胞菌占很大的比例，而维氏气单胞菌几乎没有分离到[18]造成这些差异的原因可能有地域和样品来源的不同以及细菌鉴定方法的不同等。
抗菌药物对分离株的MIC测定结果表明，所得到的气单胞菌分离株对8种抗菌药物呈现不同程度的耐药性其中，喹诺酮类药物、氟苯尼考对分离株的MIC最低，均为0.39 μg/mL分离株对恩诺沙星和盐酸环丙沙星最敏感，但同时对恩诺沙星、盐酸多西环素等6种抗菌素的耐药率持续上升，这提醒我们须要注意抗生素的合理使用，以防止耐药性的进一步上升本研究中气单胞菌分离株对盐酸环丙沙星的敏感率为76.96%，而汪永禄等对马鞍山地区66株环境源气单胞菌进行药敏试验，发现病原菌对环丙沙星的敏感率达100%[19];肖丹等研究发现94%以上的菌株对新霉素敏感[20]，而黄玉萍等发现复合水产养殖环境中57株气单胞菌对新霉素的耐药率达33.33%[21]不同地区、不同养殖品种、不同用药习惯，对水生动物病原菌的耐药性均有一定的影响后续将开展耐药基因的检测，以探讨气单胞菌基因型与耐药性的相关性作为相关检验领域的“金标准”，CLSI初期公布的判定标准主要针对人医以及人类抗生素随后，该机构在2013年发布了兽医药物敏感性试验标准该标准与欧盟药敏试验标准委员会（EUCAST）公布的标准一起成为目前我国兽用抗菌药耐药判定标准的主要依据。
然而数据并不完整，尤其是针对对象不同、药物种类与判别依据更是存在一定差异[22]本研究中红霉素的判定折点标准是参考其他菌株进行的，恩诺沙星的标准也是参考其他喹诺酮类药物因此，目前仍没有符合我国国情的、符合渔业不同养殖品种的耐药判定标准，这给水产药物的科学使用带来一定的困扰本研究通过对江苏省水生动物气单胞菌分离株开展耐药性监测，了解了气单胞菌耐药情况，以期为制定耐药判定标准和指导水产科学用药提供一定的数据基础参考文献：[1]任亚林，李 耘，韩 刚，等. 水产品中嗜水气单胞菌耐药性研究进展[J]. 生物工程学报，2019，35（5）：759-765.[2]Janda J M，Abbott S L. The genus Aeromonas：taxonomy，pathogenicity，and infection[J]. 。