hnD：〃 13127296956&ad id=&am id=&cm id=&Dm id= 培养器皿 面积（cm2）培养液量（ml） 细胞量105 5x105106 2.5x1062x1065.2x10613.7x1065x1062x10796孔培养板0.32 0.1 24孔培养板2 1.0 12孔培养板4.5 2.0 6孔培养板9.6 2.5 3.5 cm 培养 1111 8 3.0 6 cm培养皿21 5.0 10 cm 培养皿 55 10.0 25cm2 培养瓶 25 5.0 75cm2培养瓶 75 15〜30 细胞计数（转载） 来源：甚生科的日志1=1■实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细 胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目具体操作：一、 准备工作：取瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用二、 细胞悬液制备:细胞悬液晶制备方让是用0. 25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液 （或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液三、 细胞计数：1=1. 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上2. 制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼 蓝染液（0.4%）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下 区别活细胞和死细胞。
13. 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片 边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬 液流入旁边槽中4. 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动 计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16 个中格）中没有被染液染上色的细胞数目5. 计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：1=1 户—■（细胞悬液的细胞数）/ml=（四个大格子细胞数/4）X2X104 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1： 1稀释Hill公式中乘以顶因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm （长）XI. 0mm （宽） XO.lmm （高）=0. lmm3 而 lml = 1000mm3四、细胞计数要点：1 .进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于io"个/ml,如果细胞数目很少要 进行离心再悬浮于少量培养液中； 2. 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性i=l3. 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取 样都要混匀，以求计数准确；4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新 计数五、 初学者易犯的错误：1. 计数前未将待测悬液吹打均匀2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡i=li=l■3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中六、 本实验特殊试剂的配制：4%台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馅水研磨，加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤，4C保存使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4%即可另一例步骤：（1） 取 50 pl 细胞悬浮液与 50 u 1 trypan blue （or Erythrosinbluish）等体积 混合均匀于L 5ml小离心管中j（2） 取少许混合液（约15111）自血球计数盘chamber 方凹槽加入，盖上盖玻 片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色（或红色 -Erythrosin bluish）o=1（3） 计数四个大方格之细胞总数，再除4,乘以稀释倍数（至少乘以2,因与 trypanblue等体积混合），最后乘以10七即为每ml中细胞悬浮液之细胞数若 细胞位于线上，只计上线与右线之细胞（或计下线与左线之细胞）。
注：4大格细胞总数X稀释倍数X1074=细胞数/ml；每一大格的体积=0. 1cm X0. lcmXO. 01cm=10"4ml\=i1=1计数板计数时，最适浓度为5〜10X1（/细胞/ml,此范围外计数误差偏大高浓 度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数T75 monolayer culture制成 10ml 细胞悬浮液，取0. lml 溶液与0. 1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数 目活细胞数/方格：55, 62, 49, 59；死细胞数/方格：5, 3, 4, 6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60. 75；稀释倍数二2；细胞数/ml： 60.75X1（）4X2 （稀释倍数）=1.22X10%细胞数/flask （10ml）： 1. 22X106X 10ml=12. 2X106存活率：225/243= 92. 6%~~ — 最后再随便说说 — 原理都是一样的，我大部分也是借鉴集体智慧的结晶我个人在做的时候感觉最重要的就是悬液一定要摇均匀，否则对后续的计数影 响很大而实际上做起来也是挺简单的，多做几遍，主要的几点记住了就0K （笑） 最后，也是最重要的一点 一定要调好焦距，我们要计数的只是细胞，千万别计数其他的杂质（我最初很 乌龙，汗；还好知道的人不多==+）。