本科毕业设计（20_ 一届）乳酸菌冻干保护剂研究目录1. 引言 1L1乳酸菌的功能 11.2乳酸菌冻干技术的研究历史 11.3乳酸菌冻干损伤 11.4乳酸菌冻干保护剂的选择 11.5乳酸菌冻干保护机理 22. 材料与方法 22.1实验材料 22.2仪器与设备 33. 实验方法 33.1工艺流程 33.2实验操作 33.2.1 灭菌 33.2.2冻干保护剂的制备 33.2.2.1单一冻干保护剂的制备及选择 33.2.2.2复合冻干保护剂的制备及选择 33.3菌体的活化与培养 43.4冻|：前活菌计数 53.5菌体的收集及保护剂的添加 53.6预冻及冻干 53.7复水及活菌计数 53.7.1菌种的复水 53.7.2冻干后活菌计数 53.8存活率的计算 54. 结果与分析 54.1单—保护剂的选择 54.2复合冻干保护剂的选择 6421复合冻干保护剂的菌种存活率 64.2.2复合保护剂单因素间的相互作用 74.3最佳复合保护剂配方的确定验证 85. 讨论摘 要：乳酸菌在真空冷冻干燥过程中会受到损伤，加保护剂可以提高其存活率，从而筛选出乳酸菌存活率较高的保护剂 通过单因索比校和响应面实验设计，确定实验菌株的域佳冻干保护剂配方。
根据乳酸菌存活率m东干后1毫升样液的活菌数/ 冻干前1亳升菌液的活菌数,得出乳酸菌的存活率,最终得到冻干保护剂的最佳配方对单一保护剂作用筛选试验中，乳酸 菌存活率较高的依次是海藻糖,l-半胱氨酸，山梨醉，乙酸钠复合保护剂作用中，乳酸菌存活率最高的保护剂配方为海藻 糖11.82%, L-半胱氨酸171mg/mL,山梨醇1. 03%,乙酸钠17.15%时，此时，乳酸菌的存活率最高,为98. 737%乳酸菌在 低温、干燥、隔绝空气的环境下保藏，保护剂有利于乳酸菌菌种的保存，并冃在工业生产中，对发酵剂的制备有实际的应用 价值关键词：乳酸菌；冻干保护剂；存活率Abstract: Lactic acid bacteria in vacuum freeze-drying process will be damaged, the survival rate can be improved by adding protective agent. Higher survival rate of lactic acid bacteria selected protective agent. Compared by single factor experimental design and response surface to detennine the best experimental strains freeze protection agent formulations. Based on freeze-dried lactic acid bacteria survival rate = I ml sample solution after the number of live bacteria / I ml of bacterial suspension prior to freeze the number of live bacteria, the survival rate of lactic acid bacteria reached the final freeze-drying protective agents were the best formula.Protcctivc effect of a single agent in the screening test, followed by lactic acid bacteria survival rate of high trehalose, L-cysteine, sorbitol, sodium acetate・ Combined effect of protective agents, the highest survival rate of lactic acid bacteria formula trehalose protective agent 11.82%, L-cysteine 171 mg / L, 1.03% sorbitol, 17.15% sodium acetate, the time, the highest survival rate of lactic acid bacteria, was 98.737%.Lactic acid bacteria which was in cold, dry air environment isolated preservation, protection agent was conducive to the preservation of lactic acid bacteria, and in industrial production, which preparation of the fennent has practical valuc.Keywords: Lactic acid bacteria; Freeze-dried preservative; Survival1•引言1.1乳酸菌的功能随看我国乳制品产业的飞速发展，市场对乳酸菌产品的需求増大，尤其是乳酸菌发酵剂的质量方面， 更是得到了广泛的关注。
乳酸菌具有多种生理功能，包括治疗乳糖不耐症；促进蛋白质、单糖及钙、镁等 营养物质的吸收；分泌维维生素改善人体肠道功能，抑制腐败菌的繁殖，淸除肠道垃圾；抑制胆固醇 吸收，降血脂、降血压；以及免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力；抗肿瘤、预防癌症作用等，因此, 乳酸菌的保藏和乳酸菌发酵剂的制备是乳酸菌诸多功能得到利用的前提条件和重要保证保藏的微生物细胞在冻结状态及真空条件下升华，最后达到干燥的目的而低温、干燥和隔绝空气是 保藏菌种的几个重要因素，在这些条件下，微生物的生命活动将处于休眠状态，代谢相対静止，因此町以 长期保存1. 2乳酸菌冻干技术的研究历史真空冷冻干燥（简称冻干）技术出现在1811年左右，当时用于生物体的脱水1813年美国人Wollaston 发现水的饱和蒸气压与水的温度有关，在真空低温条件下，水容易汽化，水在汽化时将导致温度的降低 根据这一发现，1909年Shackell开始用冻干法干燥血淸和细菌1935年第一台商业用冻干机问|比，随后 冻干技术扩展到医药、食品领域现在冻干技术己经加入到高新技术领域的行列西方乳业科学家早在19 I比纪末20壯纪初，就已开始研制浓缩发酵剂，处于技术领先水平的丹麦Hansen 公司于1988年底研制的浓缩型冻干发酵剂活菌含量高10 -1012 cfu/mL,可直接应用于工业化生产。
我国 对浓缩发酵剂的研究起步较晚，目前国内己有戏投式发酵剂的专利问此，但生产过程中尚存在许多问题需 要解决目前我国在生产浓缩发酵剂的企业与发达国家存在很大的差距，影响我国乳业的发展⑴1. 3乳酸菌冻干损伤乳酸菌菌株在冷冻干燥后，于贮藏过程中最大程度的保持了乳酸菌的活性，无论从经济角度还是技术 角度來讲都是具有很高价值的微生物细胞的存活取决于许多因素，包括微生物起始浓度、培养基、非致 死性处理、冻干保护剂和复水环境等⑵保护剂可以减轻冷冻干燥或复水过程中外界因索对细胞的损害， 尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性获得适宜的冻干保护剂配方对细胞在冻干和贮藏过程中 的存活性至关重耍⑶乳酸菌细胞在冻干过程中会受到一定的损伤，包括机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、细胞代谢调节 作用损伤机械损伤是山低温时细胞内外冰晶生长产生的机械力量引起的，一般冰晶越大，细胞膜越易破 裂，从而造成细胞死亡冰晶小，对细胞膜的机械损伤也较小⑷溶质损伤又称“溶液损伤”，是山于水 的冻结使细胞问隙内的液体逐渐浓缩，从血使电解质的浓度显著増加⑸冻干过程中，细胞膜脂肪酸的不 饱和度、链的长度、链的分支状态或环绕状态存在动态变化，脂肪酸的动态变化与膜的流动性密切相关。
微生物细胞的干燥损伤很大程度上是山于膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性改变，从而导致膜 的功能失调⑹当细胞内某一关键酶失活，会造成细胞代谢受阻，积累了影响正常生理功能的某种产物， 从而整个细胞代谢紊乱，导致细胞死亡1.4乳酸菌冻干保护剂的选择对于冻干保护剂的研究有很多，主要有泡菜乳酸菌，干酪乳杆菌，瑞士乳干菌，保加利亚乳杆菌，嗜 热链球菌，双岐杆菌跆役对于这些菌种的保护剂筛选，已有很多的研究保护剂主要包括单一的保护剂 和复合保护剂两种，单一保护剂基本上是从糖类、醇类、氨基酸类、无机盐类中进行筛选，以获得最为适 合实验菌株的原料，符合保护剂的种类以及含量也山于菌种的不同而有所区别目前乳酸菌发酵剂可采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行制备，许多研究者发现冷 冻干燥具有英他方法无法比拟的优点，是制备和保存生物材料最有效的方法之一，并得到越來越广泛的应 用真空冷冻干燥发酵剂于70年代初期开始研制，现在已经开始商业化，这种发酵剂含活菌数高，发酵 活力强，遗传性稳定，便于储藏，携带方便，使用安全，因而它被广泛地应用问随着乳酸菌对人体健康有益作用机理的深入研究和揭示乳酸菌产品逐渐受到人们的重视。
乳酸菌菌 粉是生产这些产品的重要原料，而常用于制备乳酸菌菌粉的方法是真空冷冻干燥法（简称冻干）⑻而为了 提高冻干后的存活率，则需要研究乳酸菌的冻干保护剂在研究过程中，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌可 以从扫描电镜观察样品的结够与形态I 111 O1. 5乳酸菌冻干保护机理保护剂从以下方面对乳酸菌进行保护，保护剂对膜相变温度Tm的影响，冻干过程中，膜质经历了从 液晶态到凝胶态的相的变化在室温下复水吋，处于凝胶态的干燥质膜乂经历了从凝胶态到液晶态的转变, 山于膜经历了状态的转变，某些区域产生缺陷，使得膜渗漏若在冻干前加入二糖如海藻糖可降低干燥膜 的膜相转变温度,当磷脂干燥脱水时,海藻糖在失水部位以氢键和磷脂的极性端相连，防止状态的转变和 复水吋的渗漏，从而提高细胞的存活率问；保护剂对体系玻璃化转变温度的影响，玻璃化是指物质以非品 态形式存在的一种状态，其粘度极大，具有液体的性质山于这种非晶休结构的扩散系数很低，故在这种 结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳雄性“買 保护剂对蛋白结构的影响，一些亲水口能透过细胞膜的小分子保护剂能渗入细胞内抑制冰品生成、减缓冰 晶生长，冷冻时可减少对细胞的损伤；而不能穿透细胞膜的大分子保护剂有很强的亲水特性和氢键形成能 力。
保护剂利用它们的氢键和亲水基形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移，保护了细胞结构冻干保护剂的加入能保护乳酸菌的存活率，保护介质在干燥后起支撑作用，在冻干过程中起保护作用O 冻干的样殆不失原有的固体骨架结构，保持原有的形态冻干使保护介质具有多孔结构，该结构使冻干菌 粉具有理想的速溶性和速复水性冻干后菌休附着在保护介质上，大大减少了菌体暴露于外部的区域，减 少了外界环境因素对菌体的影响，降低了菌体死亡的可能性，从而提高了其冻干存活率另一方而保护剂 与菌休细胞壁结合，有助于稳定细胞内部成分，有助于菌体细胞冻干存活率的提高本实验拟以糖类、氨基酸类、醇类、无机盐类作为单因素保护剂，分别在这四类保护剂中选择岀乳酸 菌存活率较高的保护剂，再根据响应面设计复合保护剂得到各种组合下复合保护剂的存活率，得到存活 率嚴高的保护剂，并且进行验证2 •材料与方法2. 1实验材料菌种：实验室保藏菌株试剂：海藻糖（上海展云化工试剂有限公司 分。