第三章蛋白质的理化性质 及分离分析蛋白质的理化性质一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质一、蛋白质的两性解离与等电点Ö蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离性质，具有特定的等电点（pI）Ö溶液pH＝pI时，蛋白质所带正负电荷相等； pH＞pI时，蛋白质带净负电荷；pH＜pI时，蛋白质带净正电荷蛋白质变性的应用F 理论上：研究蛋白质分子结构与功能,分子量测定,亚单位拆分；F 生产生活中有利的一面：食品加工，消毒灭菌等；非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；F 生产生活中不利的一面：活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；What’s salt precipitation of protein?蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法|常用的中性盐：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等盐析时，pH在蛋白质的等电点处效果最好盐析沉淀蛋白质通常不会引起蛋白质的变性优点|盐析应用举例（1）盐析—中性盐沉淀蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法& 分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的血浆球蛋白,而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的血浆清蛋白。
因此,使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离1）盐析—中性盐沉淀Ö凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙 醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质沉淀原理：① 脱水作用——破坏水化膜；② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低2）有机溶剂沉淀法蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法& 处理条件： ① 低温操作；② 沉淀完全后尽快分离；（2）有机溶剂沉淀法蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法& 机制：破坏电荷，等电点沉淀3）酸沉淀法（1）重金属盐沉淀法（2）生物碱试剂沉淀法（除蛋白作用）（3）热凝固沉淀法（4）抗体对抗原蛋白质的沉淀3.沉淀方法：| 沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法| 沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法四、蛋白质的沉淀作用•沉降的概念•沉降速率：v=dx/dt•沉降常数与单位•应用：沉降速度法测定分子量的原理；梯度离心分离蛋白质（氯化铯）；五、蛋白质的沉降作用六、蛋白质的颜色反应1. 双缩脲反应2. 茚三酮反应3. 考马斯亮蓝G2504. 福林酚试剂反应5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应8. 坂口反应—精氨酸特有的反应六、蛋白质的颜色反应1. 双缩脲反应Ø 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色复合物 Ø 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样反应 Ø 肽键的反应，肽键越多颜色越深，粉红，紫红，蓝紫 Ø 受蛋白质特异性影响小 Ø 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度六、蛋白质的颜色反应2. 茚三酮反应灵敏度差。
3.考马斯亮蓝G-250|本身为棕色，与蛋白质反应呈蓝色|与蛋白的亲和力强，灵敏度高|1---1000微克/毫升六、蛋白质的颜色反应4. 福林酚试剂反应r酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）r福林试剂：磷钼酸-磷钨酸r与双缩脲法结合---Lowry法Ø在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应Ø蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生 磷钼蓝和磷钨蓝混合物Ø灵敏度提高100倍六、蛋白质的颜色反应5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应|浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应|生成黄色化合物|指甲、皮肤、毛发6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应| 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） | 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝 酸汞的混合物 | 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉 淀，加热后变成红色六、蛋白质的颜色反应7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应|在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在 液面交界处，即有紫色环形成|色氨酸的反应（吲哚环的反应）|鉴定蛋白质中是否含有色氨酸|明胶中不含色氨酸六、蛋白质的颜色反应8. 坂口反应—精氨酸特有的反应|精氨酸的反应（胍基的反应）|精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物|鉴定蛋白质中是否含有精氨酸|定量测定精氨酸七、蛋白质的紫外吸收性质y大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸 、酪氨酸和色氨酸。
y这三种氨基酸在280nm 附近有最大吸收 因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示 强的吸收可以对蛋白质进行定性和定量 检测 y蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280—0.74A260蛋白质的分离纯化一、分离纯化的基本方法1、盐析与等电点沉淀---根据溶解度不同分离2、层析法Ø离子交换层析法---根据电荷不同分离Ø凝胶过滤法---根据分子量、分子形状不同分离Ø亲和层析---根据特异性亲和力不同分离3、梯度离心法2、层析•层析（chromatography）是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法What’s chromatography?•主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等离子交换层换层 析分离蛋白质质凝胶过滤过滤 分离蛋白质质3、超速离心：•利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离•超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比 二、蛋白质含量的测定1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、福林酚试剂法 4、紫外吸收法 三、蛋白质相对分子质量的测定1、化学测定法 2、超离心沉降速度法 3、凝胶过滤法 4、SDS-PAGE。