酵母蔗糖酶米氏常数的测定 【目的】 1 ． 掌握蔗糖酶米氏常数测定的方法及原理 2 ． 熟悉蔗糖酶米氏常数测定的及意义 3 ． 验证底物浓度对酶促反应速度的影响 【原理】 当环境温度、 pH 和酶浓度等条件一定时，酶促反应的初速度（ V ）随底物浓度 [ S ] 增高而加快，直至达到一个极限，即最大反应速度（ V max ）依据底物浓度与酶促反应初速度的这种关系，米 – 曼（ Michaelis-Menten ）氏推倒出如下公式，称为米 – 曼氏方程式（式 3-1 ）方程式中 K m 称为米氏常数， K m 是酶的特征性常数，等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度， K m 可以近似地表示酶与底物亲合力的大小， K m 愈小，表明酶与底物的亲合力愈大测定 K m 是研究酶促反应动力学的一种主要方法林 – 贝（ Lineweaver-Burk ）氏将米 – 曼氏方程式等号两边取倒数得到的双倒数方程为林 – 贝氏方程式（式 3-2 ）实验选择不同的 [S] ，测定相对应的 V ，以 1/V 对 1/[S] 作图，得到一个斜率为 K m /V max 的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴上截距即﹣ 1/ K m （图 3-7 ），由此求出 K m 。
V = （式 3-1 ） = ? + （式 3-2 ） 斜率： K m /V max Y 轴截距： 1/V max X 轴截距： ﹣ 1/K m 图 3-7 双倒数作图法 本实验以酵母蔗糖酶为例应用制备的酵母蔗糖酶，在 pH5.0 的醋酸缓冲液中，30 ℃ 条件下测定其 K m 值其过程是：当酵母蔗糖酶在有缓冲液存在时与不同浓度的蔗糖混合，保持反应液的温度 30 ℃ ，反应 5min 后，测定还原糖生成量（还原糖的定量测定，参见第 3 篇实验 18 ）以还原糖的生成量代表反应开始阶段的初速度 ( V ) ，按照 Lineweaver–Burk 作图法求得 K m 值器材】 1 ． 中号试管 2 ． 刻度吸量管 3 ． 微量移液器 4 ． 恒温水浴箱 5 ． 冷冻离心机 6 ． 分光光度计 【试剂】 1 ． 0.2M pH5.0 醋酸缓冲液 0.2M 醋酸 30ml 与 0.2M 醋酸钠 70ml 混合 2 ． 醋酸 钠 3 ． 1 M 醋酸 4 ． 0.03M 蔗糖溶液 (1) 蔗糖的纯化：在做实验前 , 用 Bendiet 氏试剂检验蔗糖中是否有还原糖存在，如果有还原糖则需要将蔗糖纯化，纯化利用蔗糖和还原糖在乙醇中溶解度的差异 ( 表 3 -7 ) ，蔗糖在绝对量上最多，将少量的还原糖从蔗糖中洗去。
表 3-7 不同糖类在水和乙醇中的溶解度 糖 类 水中的溶解度 乙醇中的溶解度 蔗 糖 果 糖 葡萄糖 179 ＞ 200 83 0.9 6.71 1.94 纯化操作：称取干燥的蔗糖 50g ，置于 250ml 烧杯中，加入 95% 乙醇 100ml ，不时搅动，放置片刻后用布氏漏斗吸滤，沉淀用 50ml 95% 乙醇淋洗 2-3 次吸干沉淀，取少量用 Bendiet 氏试剂检验，应不具还原性；其余部分取出推置玻璃板上， 80 ℃ 烘箱干燥后备用 (2) 精确称取纯化的蔗糖 10.26g ，蒸馏水溶解，定容至 1 000ml 5 ．蔗糖酶溶液 (1) 自溶 称取 40g 的干酵母粉放在 250ml 三角瓶中，再分别放入 1.2g 醋酸钠细粉末、30ml 甲苯，充分搅拌使酵母液化，然后在 35 ℃ 水浴中间隔片刻震荡、保温 30 分钟，此时会观察到菌体自溶现象 (2) 粗酶的制备 往上述自溶液中加入 100ml 水，充分搅拌，于 35 ℃ 保温过夜第二天，将自溶液于 10,000r/min ， 4 ℃ ，离心 10min 取出离心管后分三层，用吸液管将最上层的甲苯吸去，然后可再用一药勺挡住中间块状粘稠物，倾斜离心管倒出下层清夜。
弃去粘稠物此时会有一些悬浮物存在再离心一次（ 10,000r/min ， 4 ℃ ，离心 10min ），滤清上清液，小心倒入 250ml 烧杯中，得到的溶液为无细胞抽提液即粗酶液，用 1M 醋酸调节 pH5.0 左右 4 ℃ 保存备用 (3) 蔗糖酶活性的预实验 在进行具体实验之前，通过预实验调节酶活性 ( 即酶的浓度 ) ，使本实验中最高底物浓度，在规定的实验条件下所测得的吸光度值控制在 0.8 左右，这样能达到比较满意的效果 6 ．碱性铜试剂、 标准葡萄糖溶液 (0.025mg/ml ） 、 磷钼酸试剂 参见第 3 篇实验 18 【操作】 1 ． 制备酶反应液 取中号试管 5 支，编号，按照下表操作 试剂（ ml ） 0 管 1 管 2 管 3 管 4 管 0.03M 蔗糖液 0 1.0 1.5 2.5 5.0 去离子水 5.0 4.0 3.5 2.5 0 pH5.0 醋酸缓冲液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，同时将蔗糖酶溶液一起置于 30 ℃ 恒温水浴中，保温 5min ，使温度达到平衡 蔗糖酶 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，置于 30 ℃ 恒温水浴中，准确保温 5min 。
碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀，终止酶促反应酶反应液留作还原糖的测定 2 ． 还原糖的测定 取中号试管 6 支，编号，按照下表操作 试剂（ ml ） 0 管 1 管 2 管 3 管 4 管 5 管 酶反应液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 去离子水 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0 碱性铜试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 葡萄糖标准液 0 0 0 0 0 2.0 混匀 , 沸水浴中加热 8min ，取出后勿摇动，流水冷却 磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，静置 3min 蒸馏水 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，用分光光度计于 650 nm 波长处比色测定， 0 号管作空白调零，读取并记录各管的吸光度值 3 ． 计算还原糖的生成量 按下式计算各管酶反应液在 5min 反应时间内生成还原糖的毫摩尔数 还原糖的毫摩尔数 / 管＝ 4 ．作图求 K m 值 按照 双倒数作图法 ，以各管的实际蔗糖浓度，即 1/[S] 作为横坐标，各管酶反应液在 5min 反应时间内生成还原糖的毫摩尔数为反应速度 V ，以 1/V 作为纵坐标，作图，其横轴截距为－ ，进一步求得 K m 值。
【注意事项】 1 ． 蔗糖酶的浓度与蔗糖的纯度直接影响实验结果因此，必须纯化蔗糖和进行蔗糖酶活性的预实验 2 ． 本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间 3 ． 当用 pH5.0 的醋酸缓冲液，在 30 ℃ 测定时，酵母蔗糖酶的 K m 值约为 28 mM 4 ． 还原糖与碱性铜试剂的碱性、各成分的浓度以及加热的时间等均有关系因此操作时力求条件恒定 5 ． 加入磷钼酸试剂后显色不稳定，应该迅速比色 【思考题】 1 ． 为什么要测定酶的 Km 值，有什么理论意义和使用价值？ 2 ．为什么不直接用米氏方程式进行 Km 值的测定？ 3 ． 还原糖生成量的计算公式中 和 含义是什么？ 。