同位素亲和标签技术

同位素亲和标签技术Isotope-coded Affinity Tags (ICAT)2007.12.7目录一、蛋白组学研究技术二、ICAT的发展三、ICAT原理四、ICAT的优点与缺点五、ICAT的改进——VICAT一、蛋白组学研究技术蛋白质组学（Proteomics）：细胞的整个蛋白质组成或蛋白质系 统的研究相对于基因组学，蛋白质组学旨在认识细胞内全部表达蛋白，包 括数目、水平和表达蛋白的更新，它们的序列和一切转译后对序列的 修饰，以及蛋白与蛋白、蛋白与其它分子之间在细胞内、细胞膜和细 胞外的相互作用蛋白组学分析方法包括分离和提纯蛋白；测序部分 或完整序列；识别功能和与其它分子之间的相互作用蛋白组数据和 基因组数据相结合可以帮助人们评估这个学科中出现的新的潜在靶子 定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行 鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前系统生物 科学研究的重要内容蛋白质组学研究的主要技术有：激光捕捉显微解剖法、双向凝胶 电泳、同位素亲和标签技术、蛋白质芯片技术、色谱技术、质谱技术 等二、ICAT的发展同位素亲和标签技术（isotope￿￿coded affinity tag,ICAT） 最先由Steven P. Gygi等于1999年提出。

Gygi首次用ICAT试剂对在不同碳源生长条件下的酵母细胞蛋白质 表达水平上的差异进行了定量比较,并对该方法的方法学进行了确证.(Gygi S P, Rist B, Gerber S A, et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotech, 1999, 17(10):994-999)三、ICAT原理利用同位素亲和标签试剂预先选择性地标记含半胱氨酸的肽类， 分离纯化后通过质谱进行鉴定，根据质谱图上不同ICAT试剂标记的一 对肽段离子的强度比例，定量分析它的母本蛋白质在原来细胞中的相 对丰度当对两种蛋白质样品进行比较分析时,分别加入轻型和重型ICAT 试剂,待反应完后将两种样品等量混合,TPCK-胰蛋白酶水解,过生物素 亲和层析柱分离,ICAT标记的肽片断吸附在柱上,然后洗脱进行液相色 谱-质谱分析不同来源的同种多肽会成对并相邻地出现在质谱图上, 且分子量差值为8u或4u (若肽段带2个电荷),两者峰面积的差别即为 两样品中同一种蛋白质表达的差异。

I 3.1、ICAT结构三部分：化学反应基团（与蛋白质半胱氨酸残基SH专一反应；中间连接子（结合 稳定同位素）；亲和反应基团（一种生物素亲和标签，与生物素结合选择分离ICAT标 记的多肽）试剂分为两种形式，连接子含有8个氘原子为“重型”，含有8个氢原子 为“轻型”，这两种形式的ICAT试剂质量相差8D（肽段带两个电荷时相差4D）反应半胱氨酸半胱氨酸3.2、ICAT技术的过程 • (1)利用重型和轻型ICAT试剂分别标记两种不同的蛋白质 样本，标记完全后混合，用胰酶水解成大小不同的肽段； • (2)使用生物素亲和层析法分离纯化与ICAT试剂反应的肽 段; • (3)标记的肽段洗脱后经液相色谱再次分离，串联质谱分 析峰型一致的一对肽段峰的离子强度，由此即可推断出两 种样品中同一种蛋白的相对含量A)A protein occurs in higher copy number in cell state 1 than in cell state 2. In the example the ratio is 4:1. Cysteine-containing proteins from a cell extract are labeled with the normal (cell state 1) and the deuterated form of a blocking reagent (cell state 2). After digestion with trypsin, the protein extracts are mixed and cysteine-containing peptides selectively retrieved via a biotin tag on the blocking reagent. (B) Peptides are measured by mass spectrometry, and the otherwise identical peptides will be separated in a mass spectrum by the mass difference between the labeled and unlabeled reagent (8 Da in the example). The ratio of abundances of the gene in cell state 1 compared to cell state 2 is preserved in the two peak heights or peak areas. There is more than one peak for each peptide because of the natural 13C contents of proteins. Sequencing of either of the two identical peptides in the same experiment identifies the gene product being quantitated. In the same experiment several cysteine-containing peptides from a single gene are often analyzed, and as many peptides as possible from all proteins in the extract are measured.ADH1 converts acetaldehyde to ethanol when cells are growing on hexose sugars. When other carbon sources are not available, ethanol can be utilized as the sole carbon source in yeast. This depends on ADH2 for conversion of ethanol back into acetaldehyde as the first step in the pathway where acetyl-CoA is used to fuel the tricarboxylic acid (TCA) cycle and the glyoxylate cycle for energy utilization in the cell.The peptides identified from ADH1 and ADH2 are 95% identical and differ only by a single amino acid substitution (valine for threonine). The substitution shifted the retention time of the ADH2 peptide pair by 2 min and shifted the mass by 2 Da, which allowed for unambiguous identification and analysis of gene expression levels.四、ICAT的优点与缺点ICAT的优点:① 分离在肽段水平上进行,解决膜蛋白溶解性问题,可对膜蛋白进行鉴定和 定量； ② 通过选择标记含半胱氨酸的肽段,降低了蛋白质混合物的复杂性； ③ 通过比较两种或更多种来源密切相关的蛋白质样品,可以得到不同状态 下蛋白表达量上的变化比例； ④ 对含有多个半胱氨酸残基的蛋白质,通过重复检索含多半胱氨酸的肽段 可得肯定 的鉴定和定量； ⑤ ICAT建立在色谱分离基础上,任何促进蛋白质溶解的试剂均可用； ⑥ 能够直接测量和鉴定低丰度蛋白质。

ICAT的缺点:① ICAT的分子量约为500Da ,这里对肽段来说是一个很大的修饰物,会增加 分析的复杂性； ② 无法分析不含Cys 的蛋白质； ③ 样品从处理到最后的质谱分析所经过的步骤较多,对精确的定量分析有 影响五、改进的ICAT技术尽管ICAT技术有许多优点，但是如前所述之缺点的存 在，仍不能完全满足当前蛋白质组研究的需要，因此对 ICAT试剂的研究和改进一直在进行，并取得了不少进展• 固相同位素标签试剂 • 可裂解同位素亲和标签 • 可视同位素亲和标签(visible isotope coded affinity tags,VICAT) • 磷酸化蛋白同位素亲和标签试剂VICAT-visible isotope coded affinity tagsYu Lu等描述了一种新型蛋白质标记试剂—VICATLu Y, Bottari P, Turecek F, et al. Absolute quantification of specific proteins in complex mixtures using visible isotope coded affinity tags. Anal Chem, 2004, 76(14):4104~4111）它含一个生物素亲和基团，一个碘乙酰基团（能专一性与肽的Cys残基反应）， 一个含有14C或NBD荧光团的探针（visible tag）（使标记的肽可以通过MS之外的方 法进行检测），一个可被光剪切的连接子（可以去除标签的一部分）。

特点：(1）可见标签，在分离过程中可通过电泳进行定位，更易检测；(2）光可剪切连接子，在MS分析之前，可除去大多数标签；(3）同位素标签包含13C和15N原子代替2H以确保RP-HPLC中轻型和重型标记的 肽能准确地共转移VICAT试剂标记的肽，先通过包括固相pH值梯度的等电聚焦胶条分离，然后将 IEF胶条上的目的区域所获得的肽洗脱下来，结合RP-HPLC、微内径HPLC、电喷雾离 子化串联质谱分析洗脱的肽VICAT方法对在复杂的蛋白混合物（如血清或细胞裂解液）中定量特异目的蛋白 非常有效这种可见探针从肽标记后到在MS中定量的全过程中都能对大量的目的肽 进行定量，这是一个很重要的方面，因为分析物在多步程序中的丢失是不可避免的 展望近年，利用同位素标记技术已在蛋白质组学研究中得到了广泛的应用， 但综合鉴定全蛋白质组依旧是一个难题选择性分离亚蛋白质组的稳定同位素标签和串联质谱的联用逐渐显示出 了其在简化样品复杂性方面的强大功能，为分析蛋白质表达、翻译后修饰以 及蛋白质与其它生物分子的相互作用奠定了很好的基础当然，这些技术存在许多不完善之处，目前的标记技术大多是使用一对 标记物标记两个样品中的一对目的蛋白，最近又发展出了多对标记物同步使 用，因而能够同时定量分析复杂样品中的所有蛋白质。

这些定量技术只是一个相对定量，还没有一个可以获得细胞或组织中蛋 白质表达的绝对的定量技术但是对蛋白质的绝对定量将是稳定同位素标记 技术的一个发展目标可以相信，很快将会发展出更多的特异性化学探针， 以帮助我们深入地研究蛋白质的结构、功能以及生命过程的调控机理谢谢！如有错误望提出、指正！。