2024/8/71 实验一实验一 小麦高分子量谷蛋白亚基小麦高分子量谷蛋白亚基测定测定 2024/8/72 ● ● 实验内容：实验内容：测定小麦高分子量谷蛋白亚基测定小麦高分子量谷蛋白亚基 ● ●实验目的实验目的: :①①掌掌握握利利用用不不连连续续十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)分分离离小小麦麦高高分分子子量量谷谷 蛋蛋白白亚基（亚基（HMW-GS）方法；）方法；②②了了解解小小麦麦高高分分子子量量谷谷蛋蛋白白亚亚基基的的命命名名方方法法；； ③③识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱 小麦高分子量谷蛋白亚基（小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）与小麦）与小麦的的加工品质加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的一密切相关，其组成是小麦品质预测的一项重要指标项重要指标HMW-GS作为一种分子标记，有助作为一种分子标记，有助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。
于提高小麦品质性状遗传改良的效率十二烷基硫十二烷基硫酸钠酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目前技术是目前分离小麦分离小麦 HMW-GS 的主要方法，此方法具有的主要方法，此方法具有准确、准确、微量、快速、操作简便、分辨率高等微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤其是优点，尤其是可以分析半粒无胚籽粒可以分析半粒无胚籽粒的的 HMW-GS 组成，所剩余组成，所剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方法已的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选的重经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选的重要方法 2024/8/74●实验原理：实验原理： 小小麦麦高高分分子子量量谷谷蛋蛋白白亚亚基基不不连连续续 SDS-PAGE 系系统统集集电电荷荷效效应应、、分分子子筛筛效效应应和和浓浓缩缩效效应应为为一一体体，，在在这这三三种种效效应应的的共共同同作作用用下下，，把把小小麦麦谷谷蛋蛋白白亚亚基基按按分分子量大小分离开来子量大小分离开来 以以亚亚基基组组成成已已知知的的中中国国春春小小麦麦品品种种做做对对照照，，就就可以对待测小麦品种的可以对待测小麦品种的 HMW-GS 组成进行鉴定。
组成进行鉴定 v①①电荷效应电荷效应v各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定的速度泳动一定电极，以一定的速度泳动v迁移率主要取决于迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量的大小所带电荷的多少、分子量的大小以及分子的形状以及分子的形状等因素 2024/8/76②②分子筛效应分子筛效应 由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网网络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别这种区别不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛分能力即分子筛效应分能力即分子筛效应③③浓缩效应浓缩效应 蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩 ● 实验材料、药品和器材实验材料、药品和器材实验材料：实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照实验器材：实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像 仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移计、移 液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。
液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等实验药品：实验药品：丙烯酰胺、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,,N,-四四 甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、 甘油、十二烷基硫酸甘油、十二烷基硫酸 钠、考马斯亮蓝等钠、考马斯亮蓝等 试剂配制：试剂配制：①①麦谷蛋白提取液：麦谷蛋白提取液：4g SDS + 1g DTT + 250 ml 0.5M Tris-HCl (PH = 6.8)+ 20 ml甘油甘油 + 30 mg溴酚蓝溴酚蓝 + 蒸馏水定溶至蒸馏水定溶至 100 ml②②10×电极缓冲液：电极缓冲液：Tris-HCI 30.3 g + 甘氨酸甘氨酸 144 g + SDS 10 g + 蒸馏水定溶至蒸馏水定溶至 1000ml③③30%丙烯酰胺：丙烯酰胺：30 g + 蒸馏水定溶至蒸馏水定溶至 100ml。
④④2%甲叉双丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺：2 g + 蒸馏水定溶至蒸馏水定溶至 100ml ⑤⑤ 1 M Tris-HCI（（ PH = 6.8））: 12.1g Tris + 蒸馏水定蒸馏水定 溶至溶至 100ml,用用1 N HCI 调调 PH = 6.8⑥⑥ 3 M Tris-HCI（（ PH = 8.8））: 36.3g Tris + 蒸蒸 馏水定馏水定溶至溶至 100ml,用用1 M HCI 调调 PH = 8.8⑦⑦ 10% SDS：：SDS 10g + 蒸馏水定溶至蒸馏水定溶至100ml⑧⑧ 10% 过硫酸铵：过硫酸铵：1g过硫酸铵过硫酸铵 + 蒸馏水定溶蒸馏水定溶10ml⑨⑨ 染色液：染色液：100mg G-250 + 12 g三氯乙酸三氯乙酸 + 蒸馏水定蒸馏水定溶至溶至200ml ● ● 实验操作步骤实验操作步骤1、小麦谷蛋白提取程序、小麦谷蛋白提取程序①①取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中，取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中，加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器上混合均匀；上混合均匀；②②将离心管放入将离心管放入65℃水浴锅中水浴水浴锅中水浴45min后取后取出离心管放，室温冷却；出离心管放，室温冷却；③③将冷却后的离心管将冷却后的离心管12000转转/min离心离心30min，保存于，保存于 4℃ 冰箱备用。
冰箱备用 2 电泳程序电泳程序①①封板：封板：利用利用1%琼脂封板，以防玻璃板漏胶；琼脂封板，以防玻璃板漏胶；②②凝胶配制：凝胶配制：见表见表 1③③ 制胶：制胶：按表按表1的配方分别配制的配方分别配制 8% 和和 15% 两种分离两种分离胶，然后用两个取液器进行以下操作，先吸取胶，然后用两个取液器进行以下操作，先吸取1.0ml已经已经混匀的混匀的 15% 分离胶，加到玻璃板之间，再向分离胶，加到玻璃板之间，再向 15% 分离分离胶中加入胶中加入 8% 的分离胶的分离胶0.5ml ，充分混匀后，从中吸取，充分混匀后，从中吸取 1.0ml加到玻璃板之间，如此反复操作上述步骤，加到玻璃板之间，如此反复操作上述步骤， 2024/8/712直直至至距距玻玻璃璃板板上上缘缘约约 3cm 处处时时，，向向胶胶面面上上加加一一层层正正丁丁醇醇，，静静置置，，直直至至分分离离胶胶凝凝固固倒倒置置胶胶板板，，流流出出正正丁丁醇醇，，用用蒸蒸馏馏水水冲冲洗洗胶胶面面，，用用滤滤纸纸吸吸尽尽多余水 按按表表1配配制制5%浓浓缩缩胶胶，，混混匀匀后后倒倒入入玻玻璃璃板板之之间间，，将将梳梳子子放放置置在在玻玻璃璃板板间间，，注注意意不不要要产产生生气气泡泡，，静静置置至至胶胶凝凝。
待待浓浓缩缩胶胶凝凝固固后后，，垂垂直直取取出出梳子，加蒸馏水，甩出样品槽中的残胶梳子，加蒸馏水，甩出样品槽中的残胶 2024/8/713成成 分分8%分离胶分离胶50ml15%分离胶分离胶50ml5%浓缩胶浓缩胶10mlH2O23.211.56.830%Acr13.325.01.71M Tris-HCl (pH8.8)12.512.5------1M Tris-HCl (pH6.8)------------1.2510%SDS0.50.50.110%AP0.5 (0.25)0.5 (0.25)0.1TEMED0.03 (0.02)0.020.01表表1 分离胶与浓缩胶配方分离胶与浓缩胶配方成成 分分8%分离胶分离胶50ml15%分离胶分离胶50ml5%浓缩胶浓缩胶10mlH2O23.211.56.830%Acr13.325.01.71M Tris-HCl (pH8.8)12.512.5------1M Tris-HCl (pH6.8)------------1.2510%SDS0.50.50.110%AP0.5 (0.25)0.5 (0.25)0.1TEMED0.03 (0.02)0.020.01表表1 分离胶与浓缩胶配方分离胶与浓缩胶配方 2024/8/714④④ 点样：点样：将胶板放在电泳槽中加入电极缓冲液至高将胶板放在电泳槽中加入电极缓冲液至高出内侧出内侧 玻璃板上边约玻璃板上边约0.5cm，用微量进样器吸取蛋白，用微量进样器吸取蛋白质质10-20ul分别加在每个样品槽底部凝胶面上。
分别加在每个样品槽底部凝胶面上⑤⑤ 电泳：电泳：下槽为正极，上槽为负极，每胶板下槽为正极，上槽为负极，每胶板30mA稳稳流电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部，电泳完毕流电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部，电泳完毕 2024/8/715⑥⑥ 卸胶、染色和脱色：卸胶、染色和脱色：卸下胶板，用手术剪撬开玻卸下胶板，用手术剪撬开玻璃板璃板 ，将整块分离胶浸没在，将整块分离胶浸没在0.25%考马斯亮蓝溶液考马斯亮蓝溶液中，放在摇床上缓缓摇动染色过夜；次日，取出凝中，放在摇床上缓缓摇动染色过夜；次日，取出凝胶，蒸馏水漂洗直至呈现清晰可见的蛋白质色带胶，蒸馏水漂洗直至呈现清晰可见的蛋白质色带⑦⑦ 拍照：拍照：利用凝胶成像仪或者普通像机拍照观察利用凝胶成像仪或者普通像机拍照观察 图图1小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，●● 结果分析结果分析 1 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名小麦高分子量谷蛋白亚基的命名 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率相对迁移率，，按按Payne的数字命名法命名，见图的数字命名法命名，见图1 图图1小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率， 2 小麦高分子量谷蛋白亚基小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图图谱见图 2 图图 2 部分小麦高分子量谷蛋白亚基部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱图谱2 小麦高分子量谷蛋白亚基小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图图谱见图 22 小麦高分子量谷蛋白亚基小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图图谱见图 2 图图 2 部分小麦高分子量谷蛋白亚基部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱图谱2 小麦高分子量谷蛋白亚基小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图图谱见图 2 图3 中国春、红火麦、马奎斯和济麦20 高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱 HMW-GS的的变变异异由由Glu-A1、、Glu-B1和和Glu-D1三三个个位位点点上上的的等等位位基基因因所所控控制制，，不不同同小小麦麦基基因因型型的的高高分分子子量量谷谷蛋蛋白白亚亚基基组组成成不不同同，，但但也也有有相相同同。
如如中中国国春春、、红红火火麦麦、、马马奎奎斯斯和和济济麦麦20的的高分子量谷蛋白亚基高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE图谱见图谱见 图图 3 图图3 中国春、红火麦、马奎斯和济麦中国春、红火麦、马奎斯和济麦20 高分子量谷蛋白亚基高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱图谱 ● ● 注意事项：注意事项：①① 丙烯酰胺和双丙烯酰胺有很强的神经毒性，容易丙烯酰胺和双丙烯酰胺有很强的神经毒性，容易吸附在皮肤上，且作用有积累性，称量时戴手套和吸附在皮肤上，且作用有积累性，称量时戴手套和口罩；口罩；②② 封板和灌胶时都不能产生气泡，以防漏胶及谱带封板和灌胶时都不能产生气泡，以防漏胶及谱带弯曲；弯曲；③③ 使用过的滴管、玻璃器皿要立即冲洗，以防止凝使用过的滴管、玻璃器皿要立即冲洗，以防止凝固堵塞；固堵塞；④④ 平板玻璃昂贵，实验过程中要特别小心实验结平板玻璃昂贵，实验过程中要特别小心实验结束后认真清洗放回原处束后认真清洗放回原处 2024/8/720● ● 思考题思考题1 简述小麦高分子量谷蛋白亚基不连续简述小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE原理及其注意事项原理及其注意事项2 封板和灌胶时为什么不能产生气泡？本实验是否封板和灌胶时为什么不能产生气泡？本实验是否需在低温下进行？电泳后上下槽的电极缓冲液能需在低温下进行？电泳后上下槽的电极缓冲液能否混合存放？否混合存放？3 根据实验过程总结如何做好根据实验过程总结如何做好SDS-PAGE？关键步？关键步骤有那些？骤有那些？4 绘制中国春等绘制中国春等5个样品的电泳图谱带型。
个样品的电泳图谱带型。