华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘 要 藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白， 其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接 大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成在集球藻 Synechococcus sp. PCC 7002 中，裂合酶CpeS 能催化α- APC81 位半胱氨酸残基与藻蓝胆素（PCB）的连接裂合酶CpcE/CpcF 可催化 CpcA 中 Cys- 84 与 PCB 的连接 本课题利用分子生物学方法得到含 cpcA、cpcE、cpcF 基因的各种质粒并表达了相应蛋白通过体外重组实验证明： 蛋白 CpcA 在 CpcE/CpcF 催化下与 PCB结合形成天然产物 CpcA- PCB；而在缺少 CpcE/CpcF 的情况下，蛋白 CpcA 与PCB 结合形成非天然产物（CpcA- PCB、CpcA- MBV的混合物）同时，通过体内重组证实：体内产生的 PCB 在有无 CpcE/CpcF 的情况下均能与蛋白 CpcA 结合并形成天然产物，所以在生物体内 CpcA 与 PCB 能进行一定程度的自催化连接反应并形成天然产物，通过荧光光谱计算其自催化比例为 0.2％。
本课题还通过体内重组实验证明：裂合酶 CpeS 对α- APC81 位半胱氨酸残基与藻蓝胆素（PCB）的连接有一定的催化作用，但在缺少 CpeS 的情况下，体内产生的 PCB 与 ApcA 结合形成天然产物的现象也十分明显，通过荧光光谱计算其自催化比例可达到 56％ 本课题是针对脱辅基藻胆蛋白与藻蓝胆素连接方式的研究， 将有助于研究藻胆蛋白的生物合成以及藻胆体的组装， 有助于藻蓝胆素色素蛋白的蛋白质工程优化的研究 关键词： 裂合酶 CpcE/CpcF 裂合酶 CpeS 别藻蓝蛋白 a 亚基 藻蓝蛋白 a亚基 体内重组 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Abstract Phycobiliproteins are light- harvesting proteins present in cyanobacteria. The most important step in phycobilin biosynthesis is the phycobilin addition to the apophycobiliproteins. In vivo, the correct attachment of most chromophores is catalyzed by binding- site and chromophore- specific lyases. As we know now, the covalent attachment of phycocyanobilin to the α- subunit of A- phycocyanin, ApcA, is catalyzed by CpeS. And the covalent attachment of phycocyanobilin to the α- subunit of C- phycocyanin, CpcA, is catalyzed by CpcE and CpcF. In this work, Molecular biology technique was used to construct expression plasmids containing such genes: as cpcA、cpcE、cpcF, then the cpcA was introduced into E. coli. With CpcE and CpcF, the holophycobiliproteins PCB- a- CPC was synthesized in vitro. But Without CpcE and CpcF , PCB- a- CPC was not obtained . We also prove that weather CpcE and CpcF existed or not, the holophycobiliproteins PCB- a- CPC was synthesized in vivo reconstitution. About 0.2％ of the apo- CpcA was converted to holo- CpcA- PCB in a similarly engineered E. coli strain that lacks cpcE and cpcF. In this work, We also prove that weather CpeS existed or not, the holophycobiliproteins PCB- a- APC was synthesized in vivo reconstitution. About 56％ of the apo- ApcA was converted to holo- ApcA- PCB in a similarly engineered E. coli strain that lacks cpeS. In this work, we studied ways of phycobilin addition to the apophycobiliproteins. It is useful for us to find better ways of studying phycocyanobilin. And it is useful for protein engineering optimized of phycocyanobilin chromoprotein from cyanobacteria. Key words: lyase CpcE and CpcF, lyase CpeS, a subunit of allophycocyanin, a subunit of phycocyanin，Reconstitution in vivo.独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密囗 ，在 年解密后适用本授权书 本论文属于 不保密囗 （请在以上方框内打“ √” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 概 论 1.1 蛋白质工程 蛋白质工程（Prorein engineering）是在重组 DNA方法用于“ 操纵” 蛋白质结构之后发展起来的分子生物学分支。
它是以蛋白质分子的结构及功能为基础，通过基因修饰和基因合成，对现存蛋白质加以改造，并设计和构建性能比自然界现存蛋白质更优良更符合人类需要的新型蛋白质[1] 1.2 蓝藻藻胆体 蓝藻又名蓝绿藻、蓝细菌、蓝菌等，是地球上比较原始的原核生物，其形态结构比较简单，无固定的细胞核，体内含有的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白加上叶绿体蛋白使之呈现蓝绿色[2]蓝藻捕光天线色素主要集中于紧连在类囊体膜外的藻胆体内 藻胆体(phycobilisome，简称 PBS)是存在于蓝藻和红藻中的一类捕光蛋白复合物，分布在光合膜的表面，构成光合作用能量吸收与传递的功能单位[3]隐藻中没有藻胆体，其除了含有叶绿素 a 外还含有叶绿素 c，其功能可能由叶绿素 c 代替[4] 藻胆体由藻胆蛋白（phycobiliprotein）和连接多肽组成的高度有序的超分子复合体藻胆蛋白负责吸收光能，连接蛋白负责组织藻胆蛋白形成藻胆体并调节它们吸收光的范围两者分别约占藻胆体总量的 85％和 15％从藻胆体内部来看，其能量传递是有严格的顺序的藻胆体的核心部分是别藻蓝蛋白，由核心向外放射状排列有藻红（藻红蓝）和藻蓝蛋白构成的天线杆（图 1.1） 。
图 1.1 藻胆体构成模型图 藻胆蛋白的发色基团被严密地固定和包装在盘状结构中，这些盘顺次堆迭在一华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2起，构成高度有序的藻胆体，加上连接蛋白的调节作用，使得能量只能单向地传递通过比较 PE、PC、APC 和叶绿素 a 的吸收光谱和荧光发射光谱，它们之间依次具有较强的荧光发射和吸收重迭这表明能量在光合作用系统内的传递顺序为PE? PC? APC? Chl a这和藻胆体的装配结构以及其它实验的结果是吻合的[5] 1.3 藻胆蛋白 藻胆蛋白（phycobiliprotein）是一类结构相似的色素蛋白它是由藻胆色素通过和相应的脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸的巯基以硫醚键共价结合形成的[6] 藻胆蛋白所能捕获的光能正好可以填补叶绿素和类胡萝卜素所不能捕获的光能区（图 1.2） 捕获的光能由高能色素流向低能色素，最终传递到光合作用中心在不同的环境下，藻胆体也正是根据藻胆蛋白的不同吸收特性，改变其组成以达到最佳的捕光效果，例如：生长在太阳能直射的陆地上的蓝藻，藻胆体一般含有较少或不含藻红蛋白，但在深水中的蓝藻就含有藻红蛋白，甚至是能吸收蓝绿光的藻红蛋白。
根据色素种类及其与藻胆蛋白的相互作用，藻胆蛋白[7]可分为藻蓝蛋白（phycocyanin，简称 PC） 、藻红蛋白（phycoerythrin，简称 PE）和别藻蓝蛋白（allophycocyanin，简称 APC） ，在某些没有藻红蛋白而具有异形胞的蓝藻中，还有藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin，简称 PEC） 由光谱性质，可以将 PE分为 C- PE、R- PE b- PE、 B- PE等， PC 可分为 C- PC、 R- PC[8]， APC 可分为 APC- I， APC- II， APC- III，APC- B[9,10]在某些缺乏 PE 而具有异形胞的蓝藻中还存在与 PE 集光功能类似的藻红蓝蛋白(PEC)，它代替 PE行使捕获光的功能但在隐藻中不存在 APC，其功能可能由叶绿素 C 代替[11] 每种藻胆蛋白分别由各自的α－亚基和 ß －亚基构成（部分藻胆蛋白中还存在 ?亚基） 藻胆蛋白通过脱辅基蛋白质三级结构和藻胆色素相互作用， 形成特定的构象，使其主要吸收 450～660nm 范围内的可见光 藻胆蛋白在藻类中起到捕获光能，并传递光能给光合作用反应中心的作用。
例如对于 Chroococcus 藻当照射光波长在 580nm 到 680nm之间时其光合作用量子产率基本不变， 而当照射光波长大于 680nm时其光合作用量子产率急剧下降 对于 580nm华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3到680nm的光主要是藻胆蛋白吸收， 而叶绿素a （简称Chla） 主要吸收波长大于680nm的光这说明由藻胆蛋白组成的色素系统对有效的光合作用是必要的藻胆蛋白的吸收光谱与叶绿素 a 吸收光谱恰好互补也就不是偶然现象了[12] 图 1.2 色素蛋白吸收光谱 1.4 连接多肽 不同的藻胆蛋白分子间依靠连接多肽相互连接连接多肽不仅起连接作用，而且在藻胆体的形成以及促进分子间能量传递方面有重大。