丙种球蛋白与核黄素凝胶层析分离实验目的1•学习和掌握分子筛凝胶层析法的工作原理和基本操作技术2. 学会使用ScphadcxG —50分离核黄素与丙种球蛋口1. 实验原理凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方 法当分子犬小不同的物质通过凝胶时，曲于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子 筛作用，分了大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用本实验用葡聚糖凝胶作 支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子 质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋口相对分子质量大，不能进入 凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流击层析 柱；核黄索相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力 大，移动速度慢，后流出层析柱这样就可达到分离核黄素和血红蛋口的目的 收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线在一定的温度下，同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时.该 物质在这两种介质中的浓度比是-常数.称分配系数不同化学物质的分配系数 不同层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法其两种 介质，一为固定不动，称固定相，另一为可相对流动，称流动相。
层析法已广泛应用在生物化淫领威中，无论是少量分析述是大量制备，都能 体现出它的高效性，简便性等特点在实脸室中的常用层析法有：凝胶过滤，纸 层析.薄层层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析等以下介绍几种常用的层析法凝胶过滤凝胶过滤的别名很多，如凝皎扩散层析，分子筛层析，排阻层析等这种技 术具有操作简便，冋收率高（近100%）,条件缓和等特点，但它的分离操作速度 较慢该法常用于蛋白质，多糖，核酸的分离纯化凝胶过滤的分离过程是在装冇多孔物质填料的柱中进行的柱的总体积为 Va,它包括填料的骨架体积％填料的孔体积Vi （内水体积）及填料颗粒间的 体积V外水体积）分布在填料的孔中的溶剂是同定相，分布的填料颗粒间的溶 剂是流动相填料颗粒含有许多不同大小的孔•如果待分离的物质分子大小合适, 则可以不同程度地向孔中扩散，大分子物质只能占有较少的大孔，小分子则能占 有大孔及另外一些小孔所以当不同分子量物质的混合物流经凝胶柱吋，较小的 分了在柱中停留的时间比大分于停留的时间长，于是混合物中各组分即按分于大 小分开，最先流岀的是最大的分子示意图如下所示，a小分亍图2-8凝胶层析分高不同分子■的钩质x大分子物质•小分子物质合物样品加在层析柱頂甥开始洗朝b小分子进入凝胶牘粒内•大分子 被排阻在賴粒之外C大分子先被洗脫下来d餐面示童图，小分子进入K粒内•大分子受到排阻。
用于主物材料分离的凝胶主要有交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）,聚内烯 酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel）,琼脂糖凝胶（商品名Sepharose）等如常用的交 联葡聚糖是将葡聚糖（D extran）悬浮于冇机溶剂，加入交联剂表氯醇交联聚合而 成多糖链的三维结构，这种聚合物为口色珠状微粒，是多孔性网状结构，凝胶的 孔径大小与交联剂的量冇关，交联剂多则交联度大，网状结构紧密，孔径小，反 之交联剂少则孔径大将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离首先 将样品小心自柱顶端加入，洗脱，以分步收集器收集洗脱液，测定每管物质浓度, 然后以洗脱体积为横坐标，齐物质浓度为纵坐标即得如卜•的洗脱曲线：由图可见 最先流出的物质是，A,它的分子量最大，大丁•该种凝胶的排阻限（A物质分子的 直径大于凝胶的孔径），完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全 排阻”其流经体积最小，与外水体积V最后流出的物质是C,它的分子 量最小，小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫“全渗入” 流经体积是外水体积百与内水体积Vi的和而物质B的分子量介于排阻限与渗 入限Z间，其分了能够部分地进入凝胶颗粒Z中，不能全部地不受限制的通过， 这叫做“部分排阻”或“部分渗入”。
它的流经体积V是全部外水体积加上内 水体积的一部分，即V=V0+K（1Vi式中Kd称作“排阻系数”或“分配系数”它反映了物质分子进入凝胶颗粒的 程度Kd= （Vc-V（）） / Vi当Kd二1时，Ve=V0+Vi为全渗入当Kd二0吋，VfV为全排阻当0t,则说明该物质分了与凝胶有吸附作用这三种物质的分离过程可见示意图如下：A图2-10不同分子量样品的洗脱曲线A完全排阻B部分排阻C完全不排阻Vi也可通过计算求出：Vi=aWra二凝胶千重Wi二每克干凝胶吸水毫升数丄匸 .一二柱禾區、体积Vt(ml)一相当型号的单位干凝胶柱床体积(ml/g)Vt=Vo+Vi+VgV萨凝胶骨架休积Vt二可通过测定层析柱内径及高度计算得出：Vt二 1 / 4D2h下表为交联葡聚糖凝胶的种类和规格：表2-5交联的种类和規格型分离分子量的?E1H克水/克 干凝胶柱床体积 皐升/克 干凝胶爱小溶胀时阿(B寸)«馱和蛋白质20~25匸90-1001CG-10〜700-7001.0231G-15〜1500〜15001.5331G-25100'50001000 - 50002.5531G-501500-100001500-300005.010311 G-7511000 ~ 500003000 - 800009.512-152431 G-1001000-1000004000-15000010.015 〜20725| G-1501000-1500005000 -40000015.020-30725G-200L1000~2000005000 - 80000020.050 〜40725三、实验步【器材】分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶、刻度吸管、量筒、 试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸、铅笔、玻璃棉或 海绵垫。
试剂】1. 葡聚糖凝胶 SephadexG-25 或 SephadexG-502. 核黄素饱和水溶液3. 生理盐水4・甲苯5•血红蛋白溶液 取抗凝血2ml置离心管中，2000r/min离心lOmin,使血. 细胞沉淀，弃去血浆及口细胞层向红细胞沉淀加入牛理盐水4ml,振摇洗涤， 2000r/min离心lOmin,弃去上清液，共洗涤三次向沉淀加入蒸憎水2ml,混 匀，再加入甲苯lml,猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白2000r/min离心 lOmin,取上清血红蛋口溶液备用6. 0. lmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2） 取0. lmol/L磷酸氢二钠720ml和 0. lmol/L磷酸二氢钠280ml,混匀操作】1•凝胶准备称取ScphadcxG-25 5g或ScphadcxG-50 3g,加磷酸盐缓冲液50ml,置于水 中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时），用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小 颗粒2. 装柱取直径0. 8〜1. 2cm长25〜30cm的层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管， 在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒 搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。
当凝胶颗粒沉积约2cm高时，打开出口， 使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出 速度大体相同，直至凝胶床高度达18cm吋为止关闭层析柱出口，要求凝胶床 要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整如凝胶床表面不平整， 可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其□然卜•沉，即可使表面平整凝 胶床表而要保留1cm高的缓冲液3. 样品制备将核黄素饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1（体积比）混匀4•加样打开层析柱出I」，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出 口用吸管吸取待分离样品溶液约0. 5ml,在接近凝胶床表而处沿层析柱内舉缓 缓加入打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床然后再用滴管沿层析柱内壁加 入磷酸盐缓冲液，约lcm高加样不可过多，以免分离不完全5. 洗脱将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入I I,使细玻璃管的卜•端插入液面，但 不可接触凝胶床表而将装冇磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置，使英略高于层析 柱，将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上，保持密闭状态打开下口瓶出 口，然后打开层析柱出口，使磷酸盐缓冲液缓缓流出，保持4〜6滴/min的流速 洗脱速度不可过快，以免区带不清晰。
6. 收集随着层析的进行，凝胶床将岀现两条明显的区带，血红蛋白区带在下，核黄 素区带在上当血红蛋白区带即将流出时，开始收集，每管收集约51,直到流 出液变为无色为止，约需收集5〜6管；以同样方法收集核黄素7. 测定在540nm波长下，以磷酸盐缓冲液调零，测定血红蛋口和核黄素各管吸光度四、 结果及分析以管号为横处标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线分析实验结果并说明原 因五、 注意事项1・在收集过程中，要保持流出液的流速稳定，洗脱速度控制在4滴/min 2•加样时，保持凝胶上平面不被搅动3. 液面要始终高于凝胶上平面，否则会导致干柱4. 装柱避免出现断层、气泡。