项目十九吞噬细胞功能检测一、中性粒细胞吞噬功能测定 (Neutrophil phagocytosis assay) (一)吞噬试验【实验原理 】中性粒细胞具有吞噬功能，当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合孵育一定时间后，颗粒物质被吞噬根据吞噬率和吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能试剂和器材 】1．试剂20%FCS RPMI-1640 培养液、 pH6.4 0.015mol/L PBS 、Wright 染液、金黄色葡萄球菌培养物、抗凝剂(4g/L 柠檬酸钠溶液)2．器材37℃温箱、显微镜、滴管、一次性采血针、微量细胞培养板、无菌干棉球、酒精棉球、碘酒棉球、接种环等步骤和方法 】1．热灭活葡萄球菌悬液配制取金葡菌24h 琼脂斜面培养物，用无菌生理盐水洗下菌苔，用 PBS 洗涤 2 次， 100℃加热 15min 灭活取热灭活金黄色葡萄球菌混悬于20% FCS RPMI-1640 培养液中 , 用比浊法调整浓度至6× 107/ml 4℃保存，备用2．于微量细胞培养板孔内加1 滴(约 50μl) 抗凝剂，无菌采人末梢血2滴(约 100μl) 与抗凝剂混匀3．向孔内加6× 107/ml 金黄色葡萄球菌悬液2 滴(约 100μ l) ，混匀。
4．置 37℃烛缸或5% CO2孵箱内培养30min5．取 1 滴培养液推片，自然干燥，Wright 染色，水洗，干燥，油镜镜检结果判定 】计数 200 个中性粒细胞， 并分别记下吞噬细菌的细胞数和各个细胞吞入的细菌数计算吞噬率和吞噬指数：％菌的中性粒细胞数个中性粒细胞中吞噬细吞噬率＝100 200200200200菌总数个中性粒细胞吞噬的细吞噬指数＝【注意事项 】1．所用器材要洁净2．越接近片子末梢细胞数越多，计数时应取片子前、中、后三段计数， 以提高准确性3．抗凝剂用量要适当，过高则抑制吞噬功能，过低使血液凝固方法评价 】此法易操作、不需特殊设备，省时，费用低廉结果直观，可用于评价其他方法获得的结果，但是光学显微镜分辨率低，有时难以计数吞入的细菌颗粒临床意义 】本试验可用于检测有吞噬功能障碍的病症，如结合NBT 试验，在一定程度上可反映机体的免疫功能状态，也可用于有免疫调节活性药物的筛选思考题 】1．简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理及临床意义2．此法在操作过程中应注意哪些事项？(二)硝基蓝四氮唑(NBT) 还原试验【实验原理 】细菌感染时， 中性粒细胞糖分解代谢活性增强，糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬的或渗透到中性粒细胞胞浆内的NBT(nitro blue tetrazolium) 染料接受，使淡黄色的NBT 还原成蓝黑色的甲(formazan)，以折光性很强的点状或斑块状颗粒沉积于中性粒细胞的胞浆内，在光学显微镜下易被识别，借此可以测定中性粒细胞的杀菌功能。
NBT 还原反应的结构式如下：N NN NCR+ H+N NN NCHH2四氮唑基甲基【试剂和器材 】1．NBT(Sigma 产品 )染液取 0.28g NBT ，加入 100ml 0.9% NaCl ，用超细玻璃滤器过 滤；小量分装，冰冻保存2．0.77%沙黄 O(safranin O ，Fisher 产品 )染液取 1g 沙黄 O 加入 100ml 蒸馏水和40ml甘油3．培养液取 0.5ml 正常血清加入0.3ml 无菌生理盐水和0.6ml NBT 染液4．试剂无菌生理盐水、甲醇等5．器材37℃温箱、显微镜、载玻片、盖玻片、湿盒、一次性采血针、酒精棉球、无菌干棉球等步骤和方法 】1．无菌取人末梢血1 滴于盖玻片上2．将盖玻片放入湿盒，置37℃温育 20min3．用无菌生理盐水仔细洗去血凝块4．取载玻片，滴加1 滴培养液，将盖玻片反扣在培养液上5．放入湿盒，置37℃温育 30min6．取下盖玻片，空气中快速干燥7．用甲醇固定1min ，用蒸馏水洗涤8．用 0.77%沙黄 O 染液染色5min，水洗，放在载玻片上镜检结果判定 】甲阳性细胞体积大，母细胞样，与正常形态PMN 不同，它们充满蓝色沉淀物。
正常人甲阳性 PMN ≥30%注意事项 】1．NBT 染液应过滤，不要残留颗粒；注意保存，不要被细菌污染2．所有器皿应洁净，避免玻璃表面因素增加NBT 的还原作用3．血凝块应用无菌生理盐水轻轻冲洗，以免将中性粒细胞冲掉方法评价 】该试验方法简单、快速、便于重复，但易出现假阳性和假阴性结果临床意义 】此试验为慢性肉芽肿病人检测的筛选试验，这些病人无甲阳性细胞， 疾病隐性携带者 结果小于正常人此外，细菌感染(尤其是全身感染)者 NBT 阳性率可升高思考题 】1．简述 NBT 还原试验的原理2．NBT 还原试验有何临床意义？二、白细胞杀菌功能测定 (Leukocyte bacterial killing assay) 【实验原理 】将白细胞与细菌、调理素按一定比例混合、培养； 短时间作用之后再加入抗生素以杀死胞外细菌， 因抗生素不能进入细胞，故吞入胞内的细菌存活；定时取样将白细胞用蒸馏水溶解，释放出细菌，进行培养、计数生长的菌落即可了解中性粒细胞的杀菌功能主要试剂和器材】1．青霉素 -链霉素液浓度分别为5000U/ml 和 5000μ g/ml ，用 Hanks 液配制2．调理素至少取 5 个 AB 血型个体血清，混合后小量分装，置-70℃保存，不要反复冻融。
3．无菌 Hanks 液、蒸馏水、生理盐水4．硅油处理过的无菌试管、离心管、吸管5．无菌平皿操作方法 】1．细菌悬液制备(1)将金黄色葡萄球菌502A 接种于肉汤培养基中，置37℃培养过夜2)3000r/min 离心 10min 去上清，并用10ml 生理盐水离心洗涤3)用生理盐水调配菌悬液，用540nm 波长比浊使吸光度约在0.164)用 Hanks 液将菌悬液稀释50 倍(菌含量约107/ml) ，备用2．白细胞悬液制备(1)用含肝素 (100U/ml 血)的注射器采血10~20ml ，置试管中2)加入 1/5 体积的 6％右旋糖酐 (分子量 200～400kDa)生理盐水溶液，混匀后在37℃直立放置 30～60min3)取血浆层，室温1500r/min 离心 5min，去上清4)用 hanks 液洗涤，配成浓度为107/ml 的细胞悬液3．实验操作(1)混合液制备 ①取无菌试管，实验管中加入Hanks 液 0.3ml，正常人血清0.1ml，白细胞悬液0.5ml ，细菌悬液0.1ml，混匀细菌对照管中不加白细胞悬液，用Hanks 液代替，其它同实验管，混匀②放 37℃摇动培养③细菌对照管于0 时、 20min、1.5h、 3h 取样培养计数菌落。
实验管于20min 、1.5h、3h 取样培养计数菌落；20min 取样后立刻于实验管中再加入0.02ml 青霉素 -链霉素液2)从细菌对照管取样培养计数菌落 ①试管中加入水温37℃的蒸馏水9.9ml 和培养的混合液0.1ml，加盖，剧烈振摇②各取 0.1ml 、1.0ml ，加到两个平皿中，并分别标记1:1000、1:100 稀释③分别倒入营养琼脂(预先煮沸融化，再57℃水浴平衡 )，呈 8 字形移动平皿轻轻混匀④37℃培养 48h，计数菌落，在半对数纸上作图(图 3-2)3)从实验管取样培养计数菌落① 试管中加入0.1ml 培养的混合液，再加入Hanks 液 5ml②室温 1500r/min 离心 5min，去上清③用 Hanks 液洗涤， 再将沉积细胞用1.9ml 蒸馏水混悬， 并用吸管剧烈上下吹打使细胞溶解④各取 0.1ml 、1.0ml ，加到两个平皿中，并分别标记1:200、1:20 稀释⑤按细菌对照操作步骤③、④进行倾倒平板、培养、计数菌落、作图结果判断 】正常人中性粒细胞在培养90min之后，胞内存活的金黄色葡萄球菌的数量应降低≥ 102倍 (图 30-1)注意事项 】1．分离白粒细胞和实验用的试管、离心管等应硅化处理，以防止细菌和白细胞黏附。
2．须用新鲜分离的白细胞做实验3．整个实验过程应注意无菌操作应用与评价 】该试验被认为是评价中性粒细胞功能缺陷的最好试验方法，因为与中性粒细胞吞噬过程相关的如黏附、趋化、吞噬、呼吸爆发、脱颗粒等任何阶段缺陷均可影响中性粒细胞的杀菌活性但由于该方法操作麻烦，故只在其它方法不能进行诊断时才应用此方法也可用于测定血清的调理活性和吞噬率，前者用新鲜人血清标本(20％血清 )代替调理素可进行检测；后者可在混合物温育15～ 30min 后涂片、染色检查临床意义 】用于诊断慢性肉芽肿病(CGD)、Ch é diak-Higashi 综合征、 严重葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶缺陷症、髓过氧化物酶缺陷症等中性粒细胞杀菌功能缺陷病CGD 的隐性携带者结果介于正常人和 CGD 之间思考题 】1．白细胞杀菌试验测定有何临床应用价值？2．试验中应用抗生素有何意义？三、巨噬细胞吞噬功能测定 (Macrophage phagocytosis test) 【实验原理 】巨噬细胞对颗粒性异物有很强的吞噬功能当鸡红细胞被注入小鼠腹腔时，会被腹腔中的巨噬细胞吞噬取小鼠腹腔液涂片、染色，在显微镜下可见到鸡红细胞被吞噬的现象计算吞噬百分率和吞噬指数，可判断巨噬细胞的吞噬功能。
试剂和器材 】1．动物体重 20~25g 的健康小白鼠2．1%鸡红细胞 (CRBC) 悬液自鸡腋静脉或心脏采血，放Alsever 液中保存 (鸡血与Alsever 液 1:5 混合 )，置 4℃可有效保存1 个月，临用前用生理盐水将CRBC 洗 3 次，按红细胞压积配成1%CRBC 悬液20901801021031041051061070细菌对照CGD正常人培养时间 (min)细 菌 存 活 数（Log）图3-2 正常人和 CGD患者中性粒细胞杀菌曲线3．6%可溶性淀粉肉汤培养基取肉汤培养基100ml，加入可溶性淀粉6g，混匀，置100℃水浴煮沸消毒4．其它试剂瑞氏 (Wright) 染液、生理盐水等5．器材无菌注射器及针头、剪刀、镊子、解剖盘、载玻片、显微镜等步骤和方法 】1．于试验前3 天向小白鼠腹腔注射6%可溶性淀粉肉汤培养基1 ml2．于试验当天向小白鼠腹腔注入1% CRBC 悬液 0.5 ml，并轻轻揉腹3．30min 后小白鼠颈椎脱臼处死，取腹腔液涂片，自然干燥后瑞氏染色，用油镜观察结果判定 】镜下可见巨噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核被染成蓝色。
置油镜下随机观察100 个巨噬细胞， 计数吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数和吞噬的鸡红细胞总数1 0 0 % 100CRBC%的巨噬细胞数吞噬吞噬率100CRBC100总数个巨噬细胞吞噬的吞噬指数【注意事项 】1．涂片的薄厚要适当，否则影响计数2．小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏3．如小鼠腹腔液过少，可注入适量生理盐水4．剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果5．被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间方法评价 】小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能体内测定法较为简单、易于操作且重复性较好，淀粉诱导后小鼠腹腔渗出液中含大量巨噬细胞但不能应用于临床检测临床意义 】小鼠腹腔巨噬细胞功能检测可用于研究某些药物的免疫调节机制，也可用于药物的筛选和判断某些理化因素的生物效应思考题 】1．简述巨噬细胞吞噬功能测定的原理2．试述巨噬细胞吞噬和杀菌机制。