香菇多糖的分离纯化(水提醇沉法) 香菇多糖的提取、纯化（水提醇沉法） 一、实验目的 了解并掌握水提醇沉法提取香菇多糖的原理和方法 二、实验原理 提取香菇多糖的方法有：水提醇沉法（热水浸提法）、碱浸提法和酶解法水提醇沉法是最常见的方法香菇多糖溶于水热水浸提时，香菇的组织细胞破裂，多糖成分浸出，再用乙醇沉淀香菇多糖 料液比、温度、时间、PH值、乙醇浓度、提取次数都是影响提取效果的重要因素最佳提取条件为：料液比1:40（30~40倍均可），提取温度为80~95℃，提取时间2h，提取时的乙醇浓度为75%，PH值6.0~8.0，提取次数为2次三、材料和仪器 材料：香菇（取子实体）、蒸馏水、无水乙醇、Sevage试剂、 （Sevage试剂配制：取三氯甲烷和正丁醇，按照5﹕1进行混合，放置在棕色瓶中备用 仪器：分析天平、高速离心机、离心试管、冷冻干燥机、磁力搅拌器、恒温水浴锅、烧杯等 四、实验步骤 1、提取： 将干燥的香菇子实体粉碎后，加入30倍的蒸馏水，用沸水提取2h，过滤，滤渣再按第一次提取工艺提取1次，将上清液合并后于80℃下浓缩。
在冷却后的浓缩液中加入一定量95%的乙醇，使乙醇的浓度为75%，室温下放置过夜，离心，将收集到的沉淀用真空冷冻干燥机冻干，放到后4℃冰箱中保存、备用2、sevage法除蛋白： 称取得到的样品10g（含水率9.7%）充分溶解于100mL蒸馏水中加入一定体积的Sevage试剂，用磁力搅拌器剧烈搅拌20 min 左右，离心，分离粗多糖中蛋白质杂质重复2次 3、乙醇沉淀： 往除过蛋白的多糖溶液（上清液）中缓慢加入95%的乙醇，至乙醇体积占溶液总体积的75%，边加边搅拌，使多糖均匀沉淀放在4℃冰箱中6h，6000r/min 离心10min，弃去上清液，将沉淀在溶解于蒸馏水中，重复以上过程3次，将最后得到的溶液放在-40℃的冷冻干燥机中冻干，制得香菇粗多糖 五、含量测定（苯酚-硫酸法） 1、标准曲线的绘制 精确称取100 mg 葡萄糖，溶解定容于100 mL容量瓶中，得含1 mg/mL葡萄糖的对照品储备溶液，备用精确移取对照品储备液0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 mL，分别置于100 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，制成不同浓度的标准溶液。
然后从各瓶中分别移取2.0 mL标准液置于25 mL有塞比色管中，加入6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀后快速加入浓硫酸5.0 mL，于40℃水浴中显色40 min，冷却至室温后，以第1瓶溶液为参比溶液，用分光光度仪在490 nm波长处测定吸光度以浓度对吸光度作图，绘制标准曲线，并计算回归方程 2、多糖提取率的测定 精确移取提取滤液1.00 mL于100 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，作为供试液，样品供试液用苯酚-硫酸法的显色方法测定吸光度，平行测定3次，根据线性回归方程计算样品中多糖的含量多糖提取率（%）=（多糖质量/提取前香菇粉质量）×100% 。