李江华江南大学2014-9-19新型有机酸的发酵法制备技术报报告内容n一.新型有机酸概况n二.新型有机酸发酵研究进展举例u丙酮酸发酵u丙酸发酵u-酮戊二酸发酵n三.新型有机酸发酵工业展望一、新型有机酸概况新型有机酸概述柠檬酸乳酸-酮戊二酸丙酸琥珀酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有机酸是指一些具有酸性的有机化合物最常见的有机酸是羧酸，其酸性源于羧基(-COOH)新型有机酸概述新型有机酸是指一系列在食品、医药和化工等领域具有重要应用价值，但是长期以来由于结构复杂性和较高的化学反应活性无法在工业规模进行低成本生产的有机酸其中丙酮酸、-酮戊二酸和丙酸等，由于化学合成工艺复杂，成本长期维持在10万元/吨以上(普通有机酸价格仅为0.4-1万元/吨)，导致下游产品成本居高不下，妨碍了其大规模应用二. 新型有机酸发发酵研究进进展丙酮酮酸丙酮酮酸的应应用领领域丙酮酸农业： 阿托酸、谷物保护剂等多种农药合成前体食品工业： 功能饮料添加剂 减肥食品 酸味剂医药工业： 原料药 药物合成前体 药物佐剂日化工业： 防腐剂 抗氧化剂诊断检测试剂： 伯醇/仲醇检定 转氨酶测定 脂肪族胺显示剂 丙酮酮酸的生产产方式比较较化学法代谢工程改造：酶转化法发酵法筛选得到的菌种：光滑球拟酵母酿酒酵母大肠杆菌原料成本高环境污染严重原料成本高来源有限最适pH值高易感染噬菌体丙酮酸耐受性差转化率较低，副产物多生产周期较长发酵过程不稳定最适pH值低不易染菌无噬菌体高丙酮酸耐受性发酵法生产丙酮酸GlucosePyruvateGlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1, NA)PDC (B1) PT (B6) PC (Bio) B1：硫胺素NA：烟酸Bio：生物素B6：吡哆醛 30 60 90 120 2 4 6 8 0.01 0.02 0.03 0.04 0.1 0.2 0.3 0 .4 0.01 0.02 0.03 0.04 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 0 0.05 0.1 0.15 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 0 丙酮酸 / gL-1 0 0 0 0 150 烟酸 / mgL-1 硫胺素 / mgL-1 吡哆醇 / mgL-1 生物素 / mgL-1 核黄素 / mgL-1 葡萄糖消耗 / gL-1 细胞生长 / OD660 丙酮酸产率 / gg-1 选育维生素缺陷型酵母光滑球拟酵母丙酮酸代谢优化培养基中维生素供给XXXX菌株选育不同kLa下发酵动力学曲线不同kLa下溶氧、产率变化Constant kLa / h -1Parameters450300200r (IG) / (g/L)118.6119.4124.8r (RG) / (g/L) 11.9 13.2 6.4Total fermentation time / h 85 68 60Glucose consumption rate / (g/(L h)1.141.561.97w (Glucose conversion ) / % 90.0 88.9 94.9r (Pyruvate) / (g/L) 77.3 69.0 57.2Productivity / (g/(L h) 0.91 1.01 0.95Yp /s / (g/g)0.7240.6490.483d (DCW) / (g/L) 13.2 14.5 15.6Average m of the first 16 h / h-1 0.238 0.190 0.139Average m of the process / h-1 0.047 0.073 0.084r (NH4Cl consumption) / (g/L) 5.66 5.88 6.06r (KH2PO4 consumtion) / (g/L) 1.35 1.23 1.12r (Ethanol) / (g/L) 1.34 1.55 1.67不同供氧控制模式下发酵过程参数高溶氧下，丙酮酸产率较高(0.724g/g)，葡萄糖消耗速度(生产强度)较慢(1.14g/(Lh)低溶氧下，细胞消耗葡萄糖速度加快(1.97g/(Lh)，丙酮酸产率(0.483g/g)却明显下降不同供氧控制模式下发酵过程参数丙酮酸产率细胞产率发酵法生产丙酮酸代谢网络分析DO=10%DO=85%高溶氧下转化率高的原因:DO从85%到10%，PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸代谢的通量下降了63.3%辅因子分析低溶氧下生产强度提高原因：DO从85%到10%，总ATP、NADH下降31.4%、18.6%，糖耗速度上升59%总ATP下降31.4%, NADH下降18.6%生产强度(糖耗速度)DO=10%DO=85%采用单一供氧模式(高或低)，不能同时达到高转化率和高生产强度发酵法生产丙酮酸实现相对统一高产量(69.4g/L)高产率(0.636g/g)高生产强度(1.95g/(Lh)分阶段供氧模式发酵0-16h控制kLa为450h-1发酵16h后将kLa降低至200h-1发酵过程碳平衡分析前16h较高溶氧有利于碳流合成细胞；16h后耗氧速率恒定，碳流转向合成丙酮酸必须进行分阶段溶氧控制！如何分阶段？发酵法生产丙酮酸美国科学院院士LO.Ingram在PNAS上的论文11次引用本团队丙酮酸高效合成的论文，并比较表明本团队获获得了国际际最高发发酵水平。
2篇有关丙酮酸发酵微生物生理特性和优化技术的博士论文2009、2011年分别获发酵工程领域至今唯一的两篇全国优秀博士论文被世界上最大发酵公司之一日本味之素公司购买，为该公司从中国购买的唯一技术发酵法生产丙酮酸二. 新型有机酸发发酵研究进进展丙酸丙酸的应用及市场2012: 260m lbs (117,936 tonnes) 化学法：2万/吨发酵法：6万/吨（食品安全）丙酸钙价格06年全球产量37.7万吨75%用于谷物和饲料防腐消费者热衷于使用天然、绿色、健康 的发酵级丙酸钙作为食品防腐剂化学合成法微生物发酵法u 烃氧化法、乙烯羰基化法u 食品安全问题n 原料廉价、可再生n 过程绿色、环保u 环境污染严重u 资源不可再生微生物发酵法低碳、环保、绿色、安全!丙酸的生产方法丙酸杆菌代谢工程改造策略过量表达甘油脱氢酶（gldA），提高对甘油的利用速率过量表达苹果酸脱氢酶（mdh），富马酸水合酶（fumC），提高丙酸代谢途径通量gldAmdhfumC丙酸发酵的问题 丙酸杆菌对碳源利用率低，生长慢； 代谢途径过程中存在若干限速酶，大大抑制了丙酸的积累筛选丙酸高产菌从奶制品厂取样低丙酸浓度富集高丙酸浓度初筛产量检测复筛24 25 29 30 32 36菌种鉴定筛选野生型质粒细胞壁裂解条件优化Blank12345678Lysozyme00.500.50.51110ProteinaseK000.50.510.5101Result-+-条件: 溶菌酶 20 mg/mL 37 oC, 蛋白酶K 2 mg/mL 56 oC. “-” 表示细胞壁没有裂解. “+” 表示细胞壁被裂解.菌种是否含有质粒P.a253229302436质粒电泳图质粒鉴定分析质粒ORF转录水平分析丙酸高产菌、野生质粒的筛选以及质粒分析过量表达甘油脱氢酶电转化241000菌落 PCR菌种鉴定Marker1000 12 Marker1 5 11 1000 12 35 371000Marker1000 12野生菌与工程菌分批发酵对比: 丙酸(PA), : 甘油浓度, : 细胞干重(DCW), : 乙酸(AA), : 琥珀酸 (SA), : 甘油脱氢酶比酶活.2929 (pZGX03-gldA)菌株PA(g/L)YP/S(g/g)YP/A(g/g)rPA/Glycerol(g/g)生产强度(gL-1h-1)2922.0614.618.20.730.1529(pZGX03-gldA)28.23239.080.9410.20过量表达甘油脱氢酶工程菌的丙酸产量比野生菌提高了28%过量表达丙酸代谢限速酶Genome of Klebsiella pneumoniaeBlunting ligationBlunting ligationmdhfumCP. jensenii ATCC4868(pZGX04-fumC)和P. jensenii ATCC4868(pZGX04-mdh)分批补料发酵,glycerol;,PA;,LA;,DCW;,AA.富马酸水合酶基因和苹果酸脱氢酶基因表达载体的构建过量表达丙酸代谢限速酶菌株周期(h)DCW(g/L)副产物(g/L)生产强度(gL-1h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P. jensenii ATCC 4868 2283.6526.952.722.410.118-P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-gldA)2283.4134.622.862.600.15228.46P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-fumC)2283.3434.522.832.570.15628.09P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-mdh)2283.3536.092.702.510.16433.91不同菌株丙酸发酵参数对比过量表达甘油脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了28.46%过量表达富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了28.09%过量表达苹果酸脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了33.91%共表达关键限速酶mdh-fumCElectrotransformation富马酸水合酶基因和苹果酸脱氢酶基因共表达载体的构建示意图三株共表达载体pZGX04-gldA-mdh, pZGX04-gldA-fumC, pZGX04-mdh-fumC的物理图谱共表达关键限速酶不同菌株丙酸分批发酵参数对比共表达苹果酸脱氢酶和富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了36.73%共表达甘油脱氢酶和富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了39.22%共表达甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了46.31% 菌株周期(h)DCW(g/L)副产物(g/L)生产强度(gL-1h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P. jensenii ATCC 4868 2283.6526.952.722.410.118-P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-mdh-fumC)2283.1636.852.652.330.16236.73P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-gldA-fumC)2283.2637.522.852.510.16539.22P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-gldA-mdh)2283.2839.432.742.550.17346.31氧化还原电位（ORP）发酵优化不控制ORP分批发酵,甘油; ,丙酸; , pH; ,乳酸; , DCW; ,乙酸; ，ORP.不控制ORP发酵，ORP下降迅速，后期产酸能力低氧化还原电位（ORP）发酵优化不同ORP对分批发酵的影响,甘油;,丙酸;,pH;,乳酸;,DCW;,乙酸高ORP条件下，菌体浓度高；低ORP条件下，单位菌体产酸能力高氧化还原电位（ORP）发酵优化三阶段ORP控制对分批发酵的影响,甘油;,丙酸;,pH;,乳酸;,DCW;,乙酸提出三阶段ORP控制策略：0-36 h，控制ORP为-200 mV；36-156 h，控制ORP为350 mV，156 h后控制ORP为-400mV。
三阶段ORP控制分批发酵丙酸产量比不控制ORP发酵提高了27.7%10m3发酵罐放大试验丙酸10 m3罐中试发酵过程曲线 residual glycerol, PA, DCW, SA, * AA丙酸最高产量为47.28g/L，生产强度为0.197gL-1h-1全球第二家采用发酵法生产丙酸二. 新型有机酸发发酵研究进进展-酮酮戊二酸。