上海第二医科大学博士论文摘要H L A - E与母胎免疾时受的初步研究博士研究生: 赵亮导师 : 范丽安 研究员气 、 娠 早 期 ， 体 子 宫 内 (蜕 霆 嘿大 量 CD56bdgh`CD 16-NK ， 胞 这些N K细胞主要集中在着床部位， 与侵袭母体蜕膜的胎儿绒毛外滋养层细胞密切接触 因此有人提出， 母体蜕膜N K细胞与胎儿绒毛外细胞滋养层细胞之间的相互作用对胎儿的着床及胎盘形成可能具有重要的调节作用 而N K细胞受体对滋养层MH CI 类分子的识别则可能是二者相互作用的分子基础H L A - E的细胞表面表达受MH CI 类分子H L A - A 、 - B 、 - C和 H L A - G先导序列衍生多肤的调节其中尤以H L A - G分子的先导序列多肤与H L A - E分子抗原结合槽的亲和力最高 在胎盘形成过程中， 胎儿绒毛外细胞滋养层 ( e x t r a v i l l o u st r o p h o b l a s t E V T ) 表达高水平的H L A - G和少量的H L A - C ， 二者的先导肤均可与H L A - E分子结合而实现H L A - E 分子的 细胞表面表达。
另外， 最近的一些研究也证明了H L A - E分子在滋养层细胞表面的表达与此相对应的是，流式细胞术分析发现所有蜕膜 C D 5 6 + N K细胞均表达C D 9 4 / N K G 2 A N K细胞抑制性受体， 而且其表达的量相当于外周血N K细胞的5倍9 5 %以上的蜕膜N K细胞均可与可溶性的H L A - E四聚体复合物 ( t e t r a m e r i cc o m p l e x ) 结合， 且这种结 合可以 被抗C D 9 4 单克隆 抗体 所阻断 这些发 现表明，进一步深入分析 H L A - E -C D 9 4 / N K G 2在胎盘着床过程中的相互作用是非常必 要 的 因 此 夕 本 研 究 拟 以 原 因 不 明 卫 丝 丝 远 己 ( re c u rre n t sp o n ta n e o u s a b o rt io n R S A ) 和 丝 夔 ‘鱼 血 压 鉴 鱼 延( p r e g n a n c y - in d u c e d h y p e rt e n s i o n P I H ) 为 例 从 以 下 A 个 方 面 探 索H L A - E 在 塑彭夔通全护 的 作 用 。
肠 一 部 、H L A -E 基 多 态 S A ， P IH 的 * 二为探索H L A - E 基因多态性与原因不明习惯性流产及妊高征的关联，我们采用地高辛标记的寡核昔酸探针杂交技术，对上海地区汉族5 3 例原因不明习惯性流产病人、5 8 例妊高征病人和1 5 6 例正常对照进行了H L A - E等位基因检测结果在R S A , P I H和对照组中H L A - E “ 0 1 0 1 均是最常见的等位基因，其兰 生LA 4 4 主 全 丝 竺 生 一 ————一 一 鱼 生基因频率分别为5 0 %, 4 3 . 1 %和4 2 .2 9 %，其次是E * 0 1 0 3 2 分别为2 9 .2 5 %,2 8 .4 5 %和 3 2 . 8 4 %, E * 0 1 0 3 1 则分别占2 0 . 7 5 %, 2 8 .4 5 %和2 4 .8 8 %, H L A - E * 0 1 0 2和E * 0 1 0 4 在三组标本中均未检出 检出的3 个等位基因在三组之间比较均无显著性差异 ( P > 0 . 0 5 ) 提示孕妇H L A - E 等位基因多态性与原因不明习惯性流产及妊高征的发生没有直接关联。
第二部分 H L A - E c D N A克玲与表达为了探索H L A - E与C D 9 4 / N K G 2 N K细胞受体之间的相互作用及H L A - E的表达对N K细胞功能的影响，就必须获得一个H L A - E稳定表达的靶细胞为此我们决定克隆人类 H L A - E c D N A 并将其表达在 H L A I类阴性的靶细胞L c L 7 2 1 .2 2 1 细胞上， 从而为下一步研究提供试验材料由于H L A - E分子的细胞表面表达需要I 类先导序列多肤的存在， 因此如何解决这一问题， 就成为能否实现H L A - E分子细胞表面表达的关键首先我们采用R T - P C R方法从人外周血淋巴细胞克隆获得H L A - E c D N A，并通过内核糖体进入位点 ( I R E S )将目的基因亚克隆于己 经载有H L A - A 2 的逆转录病毒表达载体p G C E N 上， 构建成H L A - A 2 / E多 顺反子表达载体 ( p G / A 2 E ) ，以 期A 2 基因的先导肤能实现H L A 一分子的细胞表面表达重组质粒经 P A 3 1 7包装后筛选高滴度的病毒上清，采用感染的方法将目的基因转入 L c L 7 2 1 .2 2 1细胞，最后经 G 4 1 8筛选及有限稀释，利用R T - P C R , W e s t e rn - B l o t 及抗H L A - E特异的单克隆抗体3 D 1 2 进行F A C S分析来检测外源H L A - E 在靶细胞的 表达。
检测结果显示， 外源H L A - E 分子在经p G / A 2 E转染的靶细胞表面获得成功表达 ( 8 8 . 7 9 %) ， 且显著高于 H L A - E阳性对照细胞株J A R ( 2 6 .2 1 %) ， 而经p G / A 2 对照载体转 染的 靶细 胞则未检 测到H L A - E 分子的细胞表面表达; 这些结果表明我们成功设计和构建了H L A - E多顺反子表达载体p G / A 2 E ， 并使H L A - E 分子 在H L A I 类阴 性的L c L 7 2 1 .2 2 1 细胞 表面 获得稳定表达， 为H L A - E的体外功能研究提供了有力的实验材料; 同时也证明了H L A - A 2的先导序列多肤能够促进H L A - E分子的细胞表面表达T a p as i n ( T A P - A ) 是T A P 三分子复合物的一个亚单位， 作为M H C I 类分子与 多肤之间的桥梁，与 M H C / 多肤的装配密切相关 为探索伴侣分子 T a p a s i n对H L A - E分子细胞表面表达的影响，我们利用p L X S N体外构建了H L A - E c D N A的逆转录病毒表达载体 ( p L X S N / E ) ，并通过感染的 方法将其转入T a p as i n阴性上海第二医科大学博士论文摘要的T 2 细胞系，利用R T - P C R , W e s t e r n - B l o t 及流式细胞术分析H L A - E分子在靶细胞的表达情况。
检测结果显示外源H L A - E 基因 在T a p a s i n 阴性的T 2 细胞表面同样获得表达 ( 7 4 . 1 3 %) ，而对照细胞及经空载体转染的T 2细胞表面则未检测到H L A - E分子的表达 本研究结果表明H L A - E分子的细胞表面表达也存在T A P非依赖的方式第三部含 H L A - E的佃胞表面未达对R S A践P I H病人外周血N K故y 5 T佃胞佃胞毒功能的影响要观察H L A - E的 表 达对N K及 y S T 细胞细胞毒活性的 影响， 就必须获 得 纯 度相对较高的效应细胞因此本研究首先通过亲和板 ( p a n n i n g )和固相抗体( s o l i d 一as e a n t ib o d y ) 法 在 体 外 分别 分 离 并 扩增了R S A 与P I H 病人 外周 血N K及 邓T细胞利用抗C D 5 6 和P E 结合的 抗邓T C R单克隆抗体对体外扩增的N K及 y S T 细胞的F A C S 分析 显示， 扩增3 周后C D 5 6 ' N K细 胞为4 1 % 左右， 随 着时 间 的 延长C D 5 6 ' N K细胞也逐 渐增加， 到5 周时 可达6 8 .2 %; 而 抗 y 8 T C R + 细胞百分率则为7 2 .7 4 ( 3 周) -9 1 . 8 3 % ( 5 周) 。
表明淋巴细胞的体外扩增是成功的随后我们通过4 h乳酸脱氢酶 ( l a c t a t e d e h y d r o g e n as e L D H ) 释放方法， 观察了H L A - E的体外表达对这些淋巴细胞细胞毒活性的影响 ( 效: 靶比例分别为5 0 : 1 ,2 5 : 1 , 1 2 : 1 和 6 : 1 ) 细胞毒结果显示在本试验的任何效靶比 例下，来自R S A ,P I H 及正常 对照组的N K 及 声 T 细 胞均不能 有效溶 解经H L A - E 转染的L c L 7 2 1 .2 2 1( .2 2 1 E )细胞，但单克隆抗体3 D 1 2 ( a n t i - H L A - E )及H P - 3 B 1 ( a n t i - C D 9 4 )的阻断可以部分恢复这些淋巴 细胞对靶细胞的杀伤，而未经H L A - E 转染的.2 2 1 细胞均 被裂解 这些 现象提示R S A及P I H病人N K及 y S T 细 胞体外 细胞毒 功能的抑制主要是由表达在靶细胞表面的H L A - E分子所介导的，而且其分子机制主要涉及效应细胞C D 9 4 / N K G 2 N K细胞受体对靶细胞表面H L A - E分子的识别。
但与正常对照相比， R S A及P I H病人N K及 y S T 细胞对靶细胞.2 2 1 及2 2 1 E 的杀伤没有显著性差异 ( P > 0 . 0 的单抗的阻断亦未能显示出这些效应细胞对，2 2 1 E的细胞毒活性在三组之间存在差异 提示R S A与P I H病人外周血N K及 y S T 细胞所表达的识别 H L A - E的 N K细胞受体与正常对照没有显著的差异滋养层H L A - E的表达对蜕膜淋巴细胞细胞毒功能的影响与R S A及P I H的发生可能没有直接的关系 但最近有研究表明， 虽然外周血N K细胞与蜕膜N K细胞表达相同上 海 第 二 医 科 大 学 博 士 论 文一一一一一一一一一一一一渔生种类的N K细胞受体，但蜕膜N K细胞抑制性C D 9 4 / N K G 2 A的表达量是外周血的 5倍因此本研究使用的效应细胞是来自 外周血而不是来自 蜕膜，这可能是R S A及P I H组N K与 y S T细胞细胞毒活性与正常对照无显著性差异的一个主要原因此外3 13 1 2 及H P - 3 13 1 的阻断并不能完全恢复效应细胞对靶细胞溶解这一现象也提示，可能还有其它机制参与这一识别过程。
同时我们利用体外建立的 N K及师 T细胞观察了其对绒癌细胞系( c h o r i o c a r c i n o r n a c e l l s ) J A R的杀伤情况， 我们意外地发现来自三组( R S A. P I H及正常对照) 标本的所有N K及 y S T细胞均不能 有效地杀伤J A R细胞 J A R细胞是一个滋养层衍生的绒癌细胞系，除表达很少量的H L A - E外，不表达任何经典和非经典的MH CI 类分子 为排除这部分H L A - E 对效应细胞的影响， 我们分别进行了3 13 1 2 和H P - 3 13 1 抗体阻断实验，但并未能恢复这些效应细胞对靶细胞的杀伤 这些结果与我们前面利用B细胞转染子.2 2 1 E所获得的结果似乎存在矛盾 其原因可能主要有以下几个方面: 1 . I L - 2 可以提高蜕膜N K细胞对滋养层细胞的细胞毒。