ICS 11.220B 41 DB 四川省地方标准DB X/ XXXXX—XXXX 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范Technical Specification for isolation and Identification of swine Gaeta virus点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施四川省市场监督管理局 发布DBXX/ XXXXX—XXXX目 次前 言 II1 范围 12 规范性引用文件 13 引导语 14 试剂与设备 14.1 试剂与耗材 14.2 主要仪器设备 15 样品的采集、保存与运输 25.1 猪只临床发病特征 25.2 临床样品的采集 25.3 保存与运输 26 病毒的细胞分离培养 26.1 样品的处理 26.2 制备单层细胞 26.3 接种细胞 26.4 病毒收获 37 病毒核酸鉴定 37.1 RNA的提取 37.2 反转录（cDNA的合成） 37.3 PCR扩增 38 结果判定 48.1 RT-PCR 48.2 病毒分离鉴定 4附录A （规范性附录） 试剂配制（规范性附录） 试剂配制 5附录B （资料性附录） 猪源盖塔病毒简介和CAP基因扩增序列 6前 言本文件由四川省农业农村厅提出。
本文件由四川省市场监督管理局发布 本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学本文件主要起草人：陈斌、朱玲、陈弟诗、周明忠、徐志文、邓飞、邵靓、李丽、周莉媛、张睿、谢嘉宾、王英、文豪、徐凯、黄先奇、陈亮、张国华、李莎莎、孙贤刚、江朝源本文件由四川省农业农村厅归口并负责解释 1猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范1 范围本文件规定了猪源盖塔病毒分离与鉴定方法本文件适用于猪及其产品中盖塔病毒病原分离和鉴定、实验室诊断、监测和流行病学调查等2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541-2016 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3 缩略语下列缩略语适用于本文件GETV：盖塔病毒PBS：磷酸缓冲液 DMEM：细胞营养液 FBS：胎牛血清HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸BHK-21：乳仓鼠肾源细胞CPE：细胞病变DNA marker：DNA相对分子质量标记RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应4 试剂与设备4.1 试剂与耗材4.1.1 所用生化试剂均为分析纯；按GB/T 6682（所有部分）一级水要求实验用书应经灭菌或采用超纯水；4.1.2 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、2×PCR混合液、1%的琼脂糖凝胶、DNA相对分子质量标记（100 bp~2000bp）；BHK-21、DMEM培养基、FBS、HEPES缓冲液(1mol/L储存液)、25cm2细胞培养瓶、0.22μm的一次性滤头、0.01mol/L pH7.0~7.4PBS(参见附录A)；4.1.3 阳性对照：GETV标准毒株；阴性对照：BHK-21细胞培养上清。
4.2 主要仪器设备微量移液器、组织破碎仪、组织研磨器、核酸提取仪、PCR仪、通用型电泳仪、凝胶成像系统、倒置生物显微镜、37℃恒温培养箱、冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃）5 样品的采集、保存与运输5.1 猪只临床发病特征在蚊虫多发季节，即每年5月至10月，猪只已正常免疫猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等疫苗，其新生仔猪出现腹泻、厌食、皮肤红变、舌颤、肢体不协调，10日龄以上小猪出现精神颓废、发热、食欲减退、日增重显著下降和妊娠母猪出现繁殖障碍综合征等临床症状时，均可认为疑似猪盖塔病毒感染5.2 临床样品的采集采取疑似猪盖塔病毒感染的淋巴结、胎盘、羊水、死胎、肺、肝、肾、小脑等靶组织约2~5g或血液样品1~2 mL，组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝血管中，编号5.3 保存与运输采集的样品应按照《兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范》（NY/T 541-2016，所有部分）要求包装和运输，尽快运送到实验室样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融6 病毒的细胞分离培养病毒分离应按照《实验室生物安全通用要求》（GB 19489，所有部分）在生物安全二级实验室进行。
6.1 样品的处理6.1.1 组织样品取0.5~1g待检组织样品，加入1~1.5ml PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，或用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3∶1（V/W）稀释反复冻融3次后，4℃ 3000r/min离心10min，取上清液，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管中编号，-70℃保存备用6.1.2 血液样品用含青、链霉素的DMEM作3∶1（V/W）稀释反复冻融3次后，3000r/min离心10min，取上清液，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管编号，-70℃保存备用6.2 制备单层细胞按常规法将BHK-21细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶分装含8%FBS的DMEM培养基5mL，细胞浓度应为2×105个/mL~3×105个/mL，培养48h6.3 接种细胞取6.1中的上清液0.2mL接种到生长状况良好的单层BHK-21细胞上（5mL工作体积）每份样品接种2-4瓶细胞，另设细胞对照2-4瓶37°C吸附1h，弃上清，加入2ml含2%FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养48h6.4 病毒收获每天观察记录细胞病变（CPE），若被检样品中有GETV，通常在接种12~48h内可出现CPE，感染BHK-21细胞后约12h，细胞出现空洞；24h后细胞明显变圆，部分开始脱落；36h后大量脱离，贴壁细胞大部分变圆。
对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三次，4℃ 3000r/min离心10min，收获病毒上清液，置-70℃保存，进行病毒核酸鉴定若接种细胞第1代72h后未出现CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37℃培养如此盲传3代，再进行鉴定7 病毒核酸鉴定对6.4中收集到细胞/病毒液，或经6.1处理后的临床样品，用RT-PCR方法进行核酸鉴定，可使用商品化的两步法或一步法RT-PCR反应试剂盒，本标准推荐使用两步法RT-PCR反应试剂盒7.1 RNA的提取选择商品化RNA柱式法或磁珠法提取试剂盒，按照说明书提取RNA，同时应设立阳性和阴性对照样品RNA提取操作应在通风柜或生物安全柜中进行，避免RNA气溶胶的污染7.2 反转录（cDNA的合成）配制反转录反应体系，使用商品化反转录试剂盒将7.1中提取的RNA反转录成cDNA，具体操作、体系参照说明书进行，cDNA于-20℃保存备用7.3 PCR扩增7.3.1 PCR引物上游引物（10µmol/L）：5’-ACCGAAGAAGCCGAAGAA-3’下游引物（10µmol/L）：5’-GCACTCRAGGTCATACTTG-3’7.3.2 PCR反应体系反应体系见表1。
表 1 RT-PCR反应体系PCR反应试剂总体积10µLµL2×TaqPCRmaster Mix5上游引物（10 µmol/L）0.5下游引物（10 µmol/L）0.5cDNA模板1ddH2O（无菌水）37.3.3 PCR反应程序反应程序见表2表 2 RT-PCR反应程序步骤时间和温度min、s/℃循环数个预变性5min/95℃1变性30s/95℃35退火30s/56℃延伸30s/72℃延伸7min/72℃17.3.4 琼脂糖凝胶电泳成像PCR扩增结束后，取适量扩增产物加到1%的琼脂糖凝胶加样孔中，并加入阳性、阴性对照和DNA marker使用电泳仪进行电泳，电压大小根据电泳槽长度确定，一般控制在4V/cm~6/cm，电泳时间为10~20min电泳结束后，将凝胶放在凝胶成像仪中观察记录成像结果8 结果判定8.1 RT-PCR8.1.1 成立条件对照成立，即电泳结果阳性对照在316bp左右出现目的DNA条带且阴性对照无条带8.1.2 阴性判定 电泳结果未出现与阳性对照316bp一致的DNA条带，判定为：GETV核酸阴性8.1.3 阳性判定电泳结果出现与阳性对照316bp一致的DNA条带，判定为：GETV核酸阳性，对扩增条带进行测序，其结果与附录B.1序列比对，进行确认。
8.2 病毒分离鉴定8.2.1 细胞发生CPE、核酸鉴定结果为阳性，且测序比对结果正确，则判定为：GETV分离鉴定阳性8.2.2 若盲传3代后，细胞并未发生CPE，但核酸鉴定结果为阳性，则继续盲传至5代后，在进行核酸鉴定，若核酸鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为：GETV分离鉴定阳性，若核酸鉴定变为阴性，则判定为：GETV分离鉴定阴性8.2.3 若盲传3代后，细胞并未发生CPE，核酸鉴定结果为阴性，则判定为：GETV分离鉴定阴性 AA附 录 A （规范性附录）试剂配制（规范性附录）试剂配制A.1 0.01mol/L pH7.0-7.4 PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4∙12H2O3.58gKH2PO40.27g灭菌双蒸水800mLNaOH或者HCl调pH值7.0至7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121℃、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4℃备用A.2 电泳缓冲液 TAE（50倍）三羟甲基甲烷碱（Tris base）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸馏水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4℃冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。
A.3 1.0%琼脂糖凝胶板制备琼脂糖1.0g1×TAE缓冲液100mL0.5ug/mL溴化乙锭5uL微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面BB附 录 B （资料性附录）猪源盖塔病毒简介和CAP基因扩增序列B.1 猪源盖塔病毒简介盖塔病毒（Getah virus）广泛分布在欧洲、亚洲、大洋洲是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）成员该病毒粒子呈球形，有囊膜及纤突，直径约70nm，单股正链RNA，病毒基因组全长约11~12kp，编码区包含2个独立开放阅读框ORF和ORF2；ORF1长约7407bp。