提高植物细胞培养中次生代谢提高植物细胞培养中次生代谢产物产量的方法产物产量的方法 初生代谢初生代谢(primary metabolism)是指能使营养物质转换成细是指能使营养物质转换成细胞结构物质、维持细胞正常的生命活动或能量的代谢，初胞结构物质、维持细胞正常的生命活动或能量的代谢，初生代谢的产物称为初生代谢产物生代谢的产物称为初生代谢产物(primary metabolites)，，如糖、蛋白质、脂类、核酸等它们是维持细胞生命活动如糖、蛋白质、脂类、核酸等它们是维持细胞生命活动所必需的所必需的次生代谢产物次生代谢产物(secondary metabolites)是指植物体内的一是指植物体内的一大类细胞生命活动或植物生长发育正常运行非必需的小分大类细胞生命活动或植物生长发育正常运行非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织子有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织和生长发育期的特异性，次生产物在植物中的合成与分解和生长发育期的特异性，次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢过程称为次生代谢(secondary metabolism) 前言前言 1.1.外植体选择外植体选择2.2.高产细胞系选择高产细胞系选择3.3.物理因素：光照、物理因素：光照、pHpH、通气、接种量、通气、接种量4.4.化学因素：培养基种类及激素化学因素：培养基种类及激素 诱导剂诱导剂 前提物质添加前提物质添加 抑制剂添加抑制剂添加 提高次生代谢物的产量的方法提高次生代谢物的产量的方法提高次生代谢物的产量的方法提高次生代谢物的产量的方法 1. 1. 外植体选择外植体选择l首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。
首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类l起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物部位的细胞，这样的细胞经然状态下能够积累次生产物部位的细胞，这样的细胞经过培养以后常常具有合成目的产物的能力，或比较容易过培养以后常常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物诱导合成目的产物Ø东北红豆杉幼嫩茎、叶片以及芽三种外植体的愈伤组东北红豆杉幼嫩茎、叶片以及芽三种外植体的愈伤组织中紫杉醇含量比较显示，以织中紫杉醇含量比较显示，以叶片叶片为外植体的愈伤组为外植体的愈伤组织，其紫杉醇含量是其它两种外植体形成的愈伤组织织，其紫杉醇含量是其它两种外植体形成的愈伤组织的的3 3倍Ø在茜草（在茜草（Rubia cordifoliaRubia cordifolia）愈伤组织培养中，来源）愈伤组织培养中，来源于于叶柄和茎叶柄和茎的愈伤组织蒽醌的积累量比来源于茎尖和的愈伤组织蒽醌的积累量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高叶的愈伤组织高 •解决植物细胞培养生产次生代谢物含量低的最有效的手段之一是解决植物细胞培养生产次生代谢物含量低的最有效的手段之一是筛选高产细胞株。
用来筛选的细胞来源可以是有足够生理和形态筛选高产细胞株用来筛选的细胞来源可以是有足够生理和形态异质性的细胞群，也可以是通过物理或化学因子诱变处理产生的异质性的细胞群，也可以是通过物理或化学因子诱变处理产生的突变体群突变体群•筛选方法筛选方法: :目测法目测法, ,放射免疫法、酶联免疫法、流动细胞测定法、放射免疫法、酶联免疫法、流动细胞测定法、琼脂小块法等琼脂小块法等2. 2. 高产细胞株的筛选高产细胞株的筛选 光照：光照：对次生代谢产物的合成有重要影响对次生代谢产物的合成有重要影响. . 不同植物细胞不同植物细胞生产次生代谢产物时生产次生代谢产物时, , 对光质和光量的要求是不同的对光质和光量的要求是不同的, , 如如玫瑰茄悬浮细胞合成花青素时玫瑰茄悬浮细胞合成花青素时, , 蓝光是促进玫瑰茄细胞产蓝光是促进玫瑰茄细胞产生花青素的最有效单色光生花青素的最有效单色光, , 产量为产量为416 mg/ L, 416 mg/ L, 和全色光和全色光差不多差不多, , 红光和橙光无效红光和橙光无效, , 其他单色光随其波长接近蓝光其他单色光随其波长接近蓝光, , 正效应增强正效应增强pHpH值：值：植物细胞培养的最适宜植物细胞培养的最适宜pH pH 值在值在5-6 5-6 之间之间, ,但也存在但也存在差异。
研究表明差异研究表明, ,南方红豆杉南方红豆杉( ( Tax us chinensis ) ) 的愈伤的愈伤组织生长及紫杉醇的含量受组织生长及紫杉醇的含量受pH pH 值的影响较大值的影响较大,pH 5.5 ,pH 5.5 对对愈伤组织生最为有利愈伤组织生最为有利, ,达接种量的达接种量的3.84 3.84 倍倍, ,但紫杉醇的含但紫杉醇的含量较量较 低低,pH 7.0 ,pH 7.0 时时, ,愈伤组织的生长量仅为接种量愈伤组织的生长量仅为接种量2.802.80倍倍, ,而紫杉醇含量却达而紫杉醇含量却达pH 5.5 pH 5.5 时的时的2 2 倍多3. 物理因素物理因素 温度：温度：不同种类的植物细胞培养对温度的要求是不同的不同种类的植物细胞培养对温度的要求是不同的, , 最最适的温度为适的温度为25 ℃25 ℃左右左右, , 超过超过30 ℃, 30 ℃, 对生长有明显的抑制对生长有明显的抑制作用作用. . 较低的温度有利于生物碱的合成较低的温度有利于生物碱的合成, , 而高温则会导致而高温则会导致次生代谢产物的合成基本停止次生代谢产物的合成基本停止通气状况：通气状况：国外学者研究发现国外学者研究发现: : 利用生物反应器培养长春花利用生物反应器培养长春花细胞生产阿玛碱时细胞生产阿玛碱时, , 溶解氧在溶解氧在29%-43% 29%-43% 时时, ,溶解氧与阿玛碱溶解氧与阿玛碱的产量显著相关。
的产量显著相关接种量：接种量：接种量影响次生代谢产物的有效积累接种量影响次生代谢产物的有效积累, , 接种时必须接种时必须满足一定的接种量满足一定的接种量 4. 化学因素化学因素4.1 培养基成分培养基成分l 培养基的营养成分：一方面要满足植物细胞的生物量培养基的营养成分：一方面要满足植物细胞的生物量 增长，另一方面要使细胞能合成和积累次生产物增长，另一方面要使细胞能合成和积累次生产物l 一般来说，增加培养基的一般来说，增加培养基的N N、、P P和和K K的浓度能促进细胞生的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度则有利于次生产物的合成长，而适当增加糖浓度则有利于次生产物的合成l 生生长长调调节节剂剂的的种种类类、、浓浓度度对对细细胞胞的的生生长长、、分分化化和和次次生生 产物的合成起着重要的作用产物的合成起着重要的作用Ø红豆杉细胞培养中，培养基中添加一定浓度的红豆杉细胞培养中，培养基中添加一定浓度的2,4-D2,4-D，可以显著提高细胞生长速率，增加细胞生物量，添，可以显著提高细胞生长速率，增加细胞生物量，添加适当浓度的加适当浓度的BABA和和KTKT，则可提高紫杉醇的积累则可提高紫杉醇的积累。
4.2 添加诱导子添加诱导子l诱诱导导子子，，是是指指能能够够诱诱导导植植物物细细胞胞中中一一个个反反应应，，并并形形成成细细胞胞特征性自身防御反应的分子特征性自身防御反应的分子l目前使用的激发子可分为两类：目前使用的激发子可分为两类：Ø非非生生物物诱诱导导子子（（abiotic abiotic elicitorelicitor）） 辐辐射射、、金金属属离离子子等Ø生生物物诱诱导导子子（（biotic biotic elicitorelicitor）） 生生物物激激发发子子根根据据其其来来源源不不同同又又可可分分为为外外源源性性诱诱导导子子（（exogenous exogenous elicitorelicitor））和和内内源源性性诱诱导导子子（（endogenous endogenous elicitorelicitor））外外源源性性激激发发子子多多来来源源于于微微生生物物，，包包括括经经处处理理的的有有机机体体如如菌菌丝丝，，或或微微生生物物机机体体浸浸提提物物以以及及由由微微生生物物产产生生的的多多糖糖类类、、蛋蛋白白质质类类以以及及脂脂肪肪酸酸类类等等内内源源激激发发子子是是来来源源于于植植物物结结构构的的化化合合物物。
如如降降解解细细胞胞壁壁的的酶酶类类、、细细胞胞壁壁碎碎片片、、寡寡聚聚糖糖以以及及其其它有机分子它有机分子 l 诱导子能增强细胞的呼吸作用诱导子能增强细胞的呼吸作用, , 提供产生次生代谢产物的提供产生次生代谢产物的 能量能量, , 使细胞结构发生变化使细胞结构发生变化, , 利于代谢物的形成、运输和积累利于代谢物的形成、运输和积累l 目前应用最广、研究最多的是目前应用最广、研究最多的是真菌诱导子真菌诱导子, , 如张长平等在如张长平等在红豆杉细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子红豆杉细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子, , 结果发现结果发现, , 紫杉紫杉醇的合成被加强醇的合成被加强, , 产量得到了显著提高产量得到了显著提高l 除真菌诱导子外除真菌诱导子外, , 目前在提高植物次生代谢产物方面研究目前在提高植物次生代谢产物方面研究得较多的还包括得较多的还包括寡糖素、茉莉酸类、金属离子和紫外光寡糖素、茉莉酸类、金属离子和紫外光等等. .金金属离子作为诱导子主要有属离子作为诱导子主要有CuCu2+ 2+ 、、CaCa2+ 2+ 、、MgMg2+2+等l 孙彬贤等以南方红豆杉悬浮细胞为材料孙彬贤等以南方红豆杉悬浮细胞为材料, , 在悬浮细胞中加在悬浮细胞中加入茉莉酸甲酯入茉莉酸甲酯, , 紫杉醇含量提高了紫杉醇含量提高了1010倍。
倍 4.3 前体饲喂前体饲喂n前体指处于目标代谢物代谢途径中上游的物质上游化合前体指处于目标代谢物代谢途径中上游的物质上游化合物作为酶的底物，其浓度高低决定了催化反应速度的大小，物作为酶的底物，其浓度高低决定了催化反应速度的大小，浓度高则反应速度大加入前体可以消除关键酶的阻碍或浓度高则反应速度大加入前体可以消除关键酶的阻碍或阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，利于次生代谢物的阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，利于次生代谢物的生产•向银杏培养基中添加异戊二烯等前体物质向银杏培养基中添加异戊二烯等前体物质, , 有效地提高了有效地提高了银杏内酯银杏内酯B B 的产量的产量. . •向东北红豆杉悬浮细胞体系中加入前体物苯丙氨酸和醋酸向东北红豆杉悬浮细胞体系中加入前体物苯丙氨酸和醋酸钠，可显著提高紫杉醇含量且在实验范围内钠，可显著提高紫杉醇含量且在实验范围内, , 随前体物浓随前体物浓度的增加促进作用加强度的增加促进作用加强. . n添加的前体物种类、浓度和时间对次生代谢产物的影响在添加的前体物种类、浓度和时间对次生代谢产物的影响在很多细胞培养中也得到体现很多细胞培养中也得到体现 4.4 抑制剂的使用抑制剂的使用•植物次生代谢是多途径的植物次生代谢是多途径的, , 是植物体内一系列酶促反应的是植物体内一系列酶促反应的结果结果, , 在离体培养条件下有初生物质向次生物质的转化在离体培养条件下有初生物质向次生物质的转化, , 也有次生物质之间的相互转化也有次生物质之间的相互转化. . 抑制剂可抑制支路代谢和抑制剂可抑制支路代谢和其它相关次级代谢途径，使代谢过程有利于目的次生代谢其它相关次级代谢途径，使代谢过程有利于目的次生代谢物的产生。