实验六 v网织红细胞计数 v血小板计数要求v熟悉网织红细胞染色的原理及形态学特点，掌握计数方法，了解注意事项和临床应用v学会镜下辨认血小板的形态，掌握血小板计数的方法和参考值，了解注意事项及临床应用红系祖细胞红系祖细胞 原红原红早幼红早幼红中幼红中幼红 晚幼红晚幼红 网织红网织红红细胞红细胞 一、网织红细胞计数一、网织红细胞计数骨髓外周血网织红细胞（reticulocyte, Ret）是有核红细胞转向无核到完全成熟红细胞的过度型细胞，其胞质中尚残留部分嗜碱性物质(核糖体和核糖核酸)，能被煌焦油蓝、灿烂甲酚蓝、中性红等活体染料染色根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为四型： I型(丝球型)，沉淀颗粒呈致密结块的网织红细胞；Ⅱ型(网型)，沉淀颗粒呈疏松结构；Ⅲ型(破网型)，沉淀颗粒呈散在结构； 在外周血中仅占0.15%Ⅳ型(点粒型)，沉淀颗粒呈少数散在分布多见于外周血，60%以上(一)染色原理网织红细胞内RNA的磷酸基（带负电荷）能与溴甲酚蓝、新亚甲蓝等碱性染料的有色反应基（带正点荷）结合，形成核酸与碱性染料复合物的蓝黑色多聚颗粒，其颗粒又联缀成线状甚至网状凡含有两个以上深染颗粒（或具有线网状结构）的无核红细胞，即为网织红细胞。
二)试剂煌焦油蓝染液（1%）v煌焦油蓝 1gv枸橼酸钠 0.4gv氯化钠 0.85gv蒸馏水加到100ml，充分溶解过滤备用三）操作 显微镜计数法2d染料+2d全血（1：1）混匀后染15min，倾少许玻片上，制备薄膜片，晃动玻片使迅速干燥，低倍镜浏览全片，选细胞分布均匀无重叠染色良好部位，油镜下观察1000个红细胞中网织红细胞数目 v 参考范围 成 人：0.008~0.02新生儿：0.02~0.06其它方法：v 网织红细胞计数仪v 荧光激活细胞术v 流式细胞术（四）注意事项v 1、红细胞必须含两个或两个以上蓝色颗粒，且无需微调显微镜即可见颗粒必须远离细胞边缘，以免与变性珠蛋白小体混淆v 2、染色时间必须充分，当室温较低时，需适当延长染色时间或置37℃水浴箱内 v 3、制片应厚薄适宜，否则会造成网织红细胞分布不均 v 4、网织红细胞体积较大，常在血膜尾部和两侧较多，计数应该兼顾v 5、复染会使网织红数值降低，因此不采用瑞氏染料复染，用二甲苯擦涂片也会使结果降低v 6、染料配制必须祛除沉渣方法学评价显微镜法v 可直接观察细胞形态，不需特殊仪器，其中试管法操作简便，重复性较好，被列为手工网织红细胞计数的参考方法v 但工作效率不高，实验精密度低。
受主观因素影响较多，且耗时费力仪器法 测定快速，重复性好，避免主观因素，易于标准化，测量细胞多，精确性高根据荧光强度可反映网织红细胞幼稚程度，并计算出网织红细胞成熟指数但幼稚白细胞、晚幼红细胞及巨大血小板等可干扰计数结果，仪器价格贵，试剂成本较高 临床应用网织红细胞计数是反映骨髓红细胞造血功能的重要指标 v 网织红细胞计数增多①溶血性贫血②放疗化疗后，造血恢复③贫血治疗有效时 ④脾功能亢进⑤红细胞生成素治疗后⑥骨髓移植功能良好的指标 v 网织红细胞计数降低①再生障碍性贫血②慢性病性贫血，如恶性肿瘤、慢性肾衰、内分泌疾病等二、血小板计数（一）原理v 将血液用适当的稀释液稀释后，充入计数池中，计数一定体积内血小板的数目，再换算成每升血液中的血小板数二）试剂与器材分为破坏红细胞稀释液：如草酸铵溶液不破坏红细胞稀释液：如红细胞稀释液血细胞计数板（三）操作步骤 v1、2ml红细胞稀释液 v2、采集10ul末梢血，充分混匀 v3、混匀的血小板悬液充池，静置10min，高倍 镜下计数中央大方格的血小板数 v4、计算：N* 10* 200* 106/L 参考范围（100-300）*109/L（四）注意事项v 1、针刺应稍深，保证采血顺畅，忌挤压，操作要迅速，无需擦掉第一滴血，若同时做其他实验时，先做血小板计数。
v 2、所用器材和稀释液必须清洁，无菌无尘器材应标准化v 3、血小板易聚集，充池前应充分混匀但不能用力太大，会破坏血小板v 4、待血小板下沉后再计数，否则结果偏低v 5、应在1h内计数完毕，否则结果偏低v 6、注意血小板与杂质、结晶等区别v 7.检查前，应避免服用影响到血小板功能的药物（五）方法学评价v 目视显微镜法不需特殊仪器，操作简便，成本低，但影响因素较多，耗时费力v 血细胞分析仪法重复性好，测定速度快，适用于临床应用目前血细胞分析仪逐步普及，一般均以全血作为标本但由于血细胞分析仪不能完全将血小板与其他类似大小的物质(如红细胞或白细胞碎片、灰尘等杂物)区别开来，因此计数结果有时仍需显微镜目视计数法来作校正六）临床意义v 1．生理性 正常人血小板数1d内可有6%～10%的变化，表现为早晨较低，午后较高；春季较低，冬季略高；平原较低，高原较高；月经前较低，月经后较高；妊娠中晚期升高，分娩后即降低；运动后升高，休息后恢复；静脉血比毛细血管血高10%v2．病理性 （1） 血小板减少：血小板数量低于100×109/L，原因：①血小板生成障碍：如再障、巨幼贫、急白、骨髓纤维化、放射线损伤；②血小板破坏增加：如ITP、脾亢；③血小板消耗增多：如DIC、TTP、SLE、输血后血小板减少症④血小板分布异常：如脾肿大（肝硬化）、血液被稀释（输入大量库存血或血浆） （2） 血小板增多：数量超过400×109/L。
原因：①骨髓增生性疾病：如原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、慢性粒细胞白血病；②急性大出血、急性溶血；③脾切除后；④感染及炎症性疾病：如骨髓炎、结核病、急性风湿热、类风关⑤肿瘤；不明原因的血小板增高标本中，约50％来自恶性疾病患者⑥其他：外科手术或创伤后、肾上腺皮质醇增多症、肾病综合征。