兽药小鼠精子畸形试验指导原则一、 概述(-)定义与目的小形试验是通过观察精子在药物老聃下出现崎变.以评价药物对生殖细胞的致突变作 用的一种毒理学评价方法.小St精子崎形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染 色体基因直接或间樓地决定精子形态.精子的琦形主褻是抬形态的异常，已知精子的畸形是决定精 子形成的基因发生突变的结果.因此形态的改变提示有关基因及其蛊白质产物的改变.小凰精子崎 形试鲨可检测釣物时精于生成、发育的越响，而且对巳知的生養细胞致夹变物有高度敏购性・为了确保小M.WI子畸形试验结果的真实性、可靠性和可追溯性.根据新兽药研究的规律.结合 国内兽药潘理学评价的实际情况制定了本指导原则・(二)适用范国本指导康则适用于善用化学药品、中醫药、消龙剂及词料药物添加剂对喈乳动物堆性生斌细胞 的遗传阳性检测.二、 试验设计(一)材料与方法1. 实验动物SPF级第性小亂6-8周龄.体重25・35g,数量60只左右・2 .试剂 .(1) 致究变阳性对照物可选用环磷酰胺40〜60mg/(kg d)或甲基硕酸甲fifi(MMS) 50mg/ (kgd)或丝裂瑋素C (MMC) 1.0〜l.5mg/ (kg.d),经口给子.所有致突变阳性对照物耍求分析纯以上，含量不低丁98.5%・(2) 其他试刑氯化钠：分析纯；甲醉：分析纯；伊红：分析纯.3. 生理盐水配制称取NaC10.90g置烧杯内，加适巌蒸饴水溶解，移入lOOmL容凰瓶内.混匀并用蒸饴水定容.转 移至试剂瓶内贴标签备用.4.2%伊红水溶液配制称取伊红2,OOg烧杯内.加适量蒸请水溶解.移入lOOmL容量瓶内.混匀并用蒸馆水定容"够 至试剂瓶内贴标签备用.5.仪器（1） 生物显微镜（带滤光片及lOOx物镜）（2） 细胞计数器（3） 其它实验室常用仪器（二）试验步骤1•剂量分组设3个剂11组，即1/2、1/4和I/8LD3剂量组；当受试妁物LD50人于SOOOmgAcg （或mL/kg）时. 试验组高剂量设为5000mg/kg （或mL/kg〉，将2500mg/kg （或mUkg）和 1250mg^g （或mL/kg）分别 设为中剂量和低剂■・另外设I个阳性对照组和1个阴性（溶剂）对照组.每个剂量组10只小亂，确 保给药后毎组至少存活5只动物供采样、制片.2. 受试药物溶液配制 丿根据受试蓟物理化性质.选定溶剂.将受试药物配制成水溶液（或乳化剂、混悬液、糊状物尊）. 必耍时加入增溶剂或助悬剂（如吐温・80、淀粉、裁甲基纤维素钠等）・各剂量组受试药物溶液可采用2倍递次稀释法配制.根据受试药物小MLDso,按小鼠0.1~ 0.2mL/10g体堇受试药物给予体积要求，先确定K2 LDso剂量组（即刻高剂量组）受试药物溶液需配 制的浓度以及各剂量组所需受试药物溶液体积，再拟定1/2LD5O剂輦组受试药物初始溶液潘配崗的体 积.计算潘称取/量取受试药物的量.用天平或/移液管.称取或/量取受试药物.置烧杯内.加入适量选定的溶剂溶解或/稀释.转入 容It瓶内，混匀并定容，即获得l/lLDjo剂量组（高刑童组）所需浓度的受试药物溶液.分取一半 供1/2LDJ0剂量组给药，再向原溶液中加入同体积的溶剂，混匀后溶液正好是1/4LD50剂険组（中 刑畳组〉所希的浓发；分取一半供1/4LDJ0刑虽组给药，又加入同体积的溶剂，混匀后溶液止好是 l/SLDjo剂童组（低剂量组）所需的浓度，可供其给药用・3. 试验动物称重、标记编号和分组试验前对购置的小鬣饲养观察1周。
选择50只健康雄性小夙进行个体称重和标记编号，采用完全 随机法，将小麒分为5组，每组10只.4. 给药按受试药物要求，采用淞胃（或注射）给药，1次/d,连续5d・每次给药先称取小鼠体亶，按小 鼠0.1〜U.2mL/10g体亟剂篁要求计算各小鼠应给予的受试药物体积•用注射器吸取受试药物溶液进行 给药5. 采样与制片 在弟一次给药后35d进厅采样、制片，每个剂畳组采样不小于5只小亂.礫作如下：（1） 用颈推脫臼法处死小K，剪开腹腔，分离并摘取鬥側附事.放入盛有2mL生理盐水的半皿 中：（2） 以眼科剪蒂附睾纵向剪I刀〜2刀（不宜过碎）.用吸管吸取其中的生理盐水吹打数次，静 置 3~5mim（3丿用」层擦镜抵过滤除去组织碎片.吸取滤液滴1〜2满丁载玻片上.推片.毎只小裁样制片4 张；（4） 空气中推片自然干燥后.用甲醇固定5〜lOmim干燥.（5） 用2%伊红染色45min〜lh,用水轻轻洗去染液，自然晾干后镜检.6•阅片先用低倍镜（加绿色津光片）在片中找到背景清晰、耦子賣叠絞少的部位.再用高倍适检査精 子形态.精于有头无尾（轮廓不清）、或头部与其也榊子及碎片重叠、或明显是人为剪碎者均不进 疔计数.判断収头、双尾畸形时，耍注意与二条梢子的部分重叠相鉴别，判断无定形时耍与人为剪 碎及折金相鉴别.#只小馭涂片检査计数正常精子200条以上.每个剂■:组至少检査1000条猜讥 在 檢査计数正常精子时.检査同一视野中的畸形精子，井对它们进行分类计数（分无钧、香蕉形、无 定形、取头、胖头、尾折叠、双尾7类）・琦形率二畸形精子数正常精子检査数+畸形精子数xlOO%（三）数据整理与分析1•统计各剂量组小鼠的正常精子检査数、畸形榊子数及各类畸形精子数.记录入下表:组别正常糯于检 査数■形梢子 数各类珂形精子数无 钩形无定 形胖头尾折疊双头双 尾阴性（溶剂）对照 组阳性对照组2.计算各剂臺组小取的精子髓形率（％）及各类崎形精子百分率（％）,井计算各刑址组小亂吊 子崎形率的标准差，将结果列入下表"计算公式如下：组别动物数正常構子检査数畸形精子数躅形率（気）蚕异显誉性阴性（溶剂）对照组阳性对照组X100%小眼精子畸形率畸形精子百分聿（%）=单类畸形精子数 一畸形将子数各类畸形精子百分率组别畸形精子数各类畸形精子百分率（％）无钩香蕉形无定形胖头尾折叠双头双尾阴性（溶剂）对照组阳性对照组3.每个剂量组的小鼠精子畸形率分别与阴性（溶剂）对照组的小鼠精子畸形率进行统计比较。
用Wilcoson秩和检验（非参数等级秩和检验）计算各剂量组精子畸形率的差异显著性四） 结果评价1. 首先观察阳性对照组和阴性对照组的试验结果要求阳性对照组精子畸形率增高应在质控范 围（实验历史记录）之内，阴性对照组的畸形精子率也应在质控范围（一般为0.8%〜3.4%）之内， 并且阳性对照组的畸形精子率与阴性对照组的畸形精子率有显著性差异（PV0.01）,否则所得结果 不可靠，试验应重做2. 当试验组小鼠的精子畸形率为阴性对照组的2倍或2倍以上或经统计有显著差异，并且有剂 量•反应关系，试验结果也能重复，可判断试验结果为阳性.即受试药品为精子畸形诱变剂.3. 如果试验组的给药剂量已使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果阴性五） 注意事项1. 除特别注明外，试验用水为蒸馆水,试剂为分析纯试剂，动物为SPF实验动物2. 实验动物饲养环境要求达到SPF级3. 镜检时要注意鉴别人为造成的精子损伤，特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、 双头、双尾及多尾等畸形精子假象4. 结果判定时，要注意排除机体缺血、变态反应、感染和体温增高等导致精子畸形率增高的因 素，以免造成假阳性结果。
三、 试验报告为公正、科学地评价药物的特殊毒性，对试验报告内容做如下要求：1. 试验目的2. 试验时间与地点3. 试验设计者、负责人、参加者及电子邮箱4. 受试药物需注明曽药名称、生产厂家、规格、生产批号及用法与用量5. 试验动物的品种与品系、体重、日龄或月龄、健康状况、检疫情况等6. 归纳总结该药物的试验结果，评价受试药物对生殖细胞的致突变作用7. 参考文献试验数据，应有详细的试验原始记录原始资料保存处、联系人、9.试验单位（加盖公章）四、 附录小畝正常精子及常见畸形精子类型模式图2 3 4 5 6 7 89图例说明：1— 正常精子；2— 无钩（头顶未见弯形钩）；3— —香蕉形（头部上下粗细悬殊不大，形似香蕉）;4、5、6 无定形；7一胖头（头比正常大约1/2〜1倍，着色较浅）；8— 尾折叠（仅指伴有头部畸形者）；9— 双头；10— —双尾。