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1、月季的花药培养,花中皇后月季又称“月月红”，自然花期5至11月，开花连续不断 ，通常扦插就可以成活。,1964年，印度科学家在培养茂业曼陀罗的花药时，首次获得了由花药中的花粉粒发育而来的单倍体植株。 说明生殖细胞和体细胞一样，在离体条件下也具有发育成完整植株的潜能。,自20世纪60年代以来，世界上已有250多种高等植物的花药培养获得成功。,我国已经培育成功近50种植物的花粉再生植株，如小麦、玉米、大豆、甘蔗、橡胶等。,知识回顾,单倍体育种的过程？,花药离体培养（N）,单倍体植株（N）,秋水仙素处理，使染色体翻倍,植株（2N）,特点：1 明显缩短育种年限,2 后代植株都为纯合子。,正常植株（2N
2、）,课题背景,花丝,花药：囊状结构，内有很多花粉,（一）被子植物的花粉发育,1 雄蕊,一、基础知识,2 花粉的概念:由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞.,花粉发育过程,花粉母细胞 （小孢子母细胞）,4个小孢子,减数分裂,小孢子四分体,1个小 孢子,（单细胞花粉粒）,花粉粒 （双核）,有丝分裂,单核,双核,小孢子母细胞花粉母细胞,小孢子,减数分裂,有丝分裂,花粉管细胞核,生殖细胞核,有分丝裂,精子,营养细胞,生殖细胞,（小孢子四分体时期,单核居中期,单核靠边期,双核期）,小孢子母细胞,小孢子,花粉囊,花药,花粉粒（双核期）,成熟花粉,活动1：阅读“被子植物的花粉发育”，回答下列问题：
3、,1花粉是_倍体的_细胞. 被子植物的花粉是在 中由 经过 分裂形成的。 2花粉的发育要经历不同的时期：,减数,单 生殖,（ ）分裂,（ ）分裂,小孢子母细胞（2n）,（ ）时期（n）,单核（ ）期（n）,双核期,（ ）细胞核（n）,（ ）细胞核（n）,（ ）细胞（n）,（ ）细胞（n）,（ ）个精子(n),单核（ ）期（n）,（ ）分裂,减数,小孢子四分体,靠边,有丝,居中,生殖,营养,花粉管,2,生殖,有丝,花药 花粉母细胞,（二）产生花粉植株的两种途径,移栽,原因：培养基中的激素种类及浓度配比,胚状体,在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合
4、子胚类似；,神奇的人工种子,:通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,胚状体发育途径,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤组织分化形成再生植株,水稻花药培养,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。,选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。,因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。,选材是否成功是花药培养成功的关键。,三、影响花药培养的因素,1、材料的选择：,一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花
5、药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的时期为单核靠边期。,选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎； 选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。,花药培养时期的选择,其它时期选择的缺点,为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。,选择完全未开放花蕾的原因,完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒,挑选单核期花药的方法,花药培养时间,一般月季的花药培养时间选在5月初到5月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。,花药培养所采用的培养
6、基各成分中植物生长调节剂的水平和配比起决定作用。 诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用 2，4-D、IAA； 诱导分化的培养基常除去2，4-D而以IBA代之。 亲本植株的生长条件、材料的低温预处理、接种密度等对诱导成功率都有一定的影响。,2、培养基的组成：,3、其他因素：,为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？,答：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。,为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？,讨论：,（一）材料选取,2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。 方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色) 焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。,1、从花药看：月季的初花期 从
7、花粉看：单核期 从花蕾看：完全未开放的,花药（载玻片上）1%的醋酸洋红1滴用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）,花药（在卡诺氏固定液中处理20min）取出，置于载玻片上焙花青铬矾溶液染色盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）,四、实验操作,（二）材料的消毒,5、无菌水冲洗35次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态,1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒,2、无菌水清洗,3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分,4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中24分钟 （质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）,在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药,要彻底去
8、除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。,立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。,1、剥取花药,勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织。,2、接种,注意：,（三）接种和培养,培养条件：温度控制在25左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。,3、培养,培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。 长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。,注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株
9、将很难分开。,在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养细胞核和生殖细胞核融合造成的）。,4、鉴定和筛选,四、 结果分析与评价,1、选材是否恰当,选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。,2、无菌技术是否过关,如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。,3、接种是否成功,如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。,基础知识,实验操作,被子植物的花粉发育,花粉,其他因素,影响因素,花粉发育经历的
10、时期,月季的花药培养,材料与培养基,材料的选取,产生途径,结果分析与评价,消毒,接种和培养,课堂小结,植物组织培养技术与花药培养技术的比较,自主测评,7基因型为AaBb的水稻（24条染色体）的花药通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下培养形成试管苗。 （1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成中，必须从培养基中获得 、 和小分子有机物等营养物质。 （2）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有 和 两种激素。 （3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是 _ 。 （4）试管苗的细胞核中含有 条脱氧核苷酸链。 （5）培育成的试
11、管苗可能出现的基因型有 。,水 无机盐,细胞分裂素,试管苗的生长发育所需营养来自叶绿体利用光能制造的有机物,24,AB、Ab、aB、ab,生长素,叶绿素的形成需要光,下图是月季花药离体培养产生花粉植株的两 种途径，请据图回答有关问题：,课堂练习:,(1)选用的材料合适与否是成功诱导出花粉植株的重要因素，一般来说选用 期的花粉可提高成功率。选择花粉时，一般要通过 来确定花粉是否处于合适的发育期，这时需要对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是 。 (2)上图中花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取决于培养基中 。 (3)胚状体与愈伤组织在结构上的主要区别在于愈伤组织的细胞排列疏松无规则，是一种高度 的薄壁细胞，胚状体与 发育形成的胚有类似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。 (4)无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，请说明下列各项需要消毒，还需要灭菌。培养基，培养皿，接种环，花蕾，实验操作者的双手，三角锥形瓶。 (填编号)需要灭菌， (填编号)需要消毒。,单核,镜检,醋酸洋红,激素的种类及其浓度配比,液泡化,受精卵,
