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1、基因工程的基本操作程序,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子,启动子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核
2、细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因操作的基本步骤,一、目的基因的获取 将需要的基因从供体生物 的细胞内提取出来。,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,(1)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文
3、库？ 什么是基因组文库？ 什么是部分基因文库？ 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 目的基因的有关信息与什么相联系？,概念：基因文库 （gene library）,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库与部分基因文库的关系,思考：基因文库如何构建？,如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互
4、补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的cDNA文库。这种方法称反转录法,cDNA文库的构建,反转录法：,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,（3）如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。,1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是 A、
5、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,（2）利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,PCR技术,原理： 前提： 原料 方式,PCR扩增仪,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；
6、离子,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温 A B C D,D,2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸
7、是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个,B,（3） 人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A B C D,A,D,
8、3、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人工合成,二、基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。 （2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处
9、，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同种,1.过程:,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基
10、因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞
11、,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,3、目前转基因工程可以 A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离 B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离 C. 完全突破地理隔离和生殖隔离 D. 部分突破地理隔离和生殖隔离,C,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤
12、农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花
13、粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快
14、 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细
15、菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A B C D,C,5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法 A B C D,C,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,知识延伸DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,返 回,1、用-珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是 A镰刀状细胞贫血症 B白血病 C坏血病
