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1、PCR理论基础及基本操作,李 静 2012.2.21,第一节 PCR技术,聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction PCR的基本原理 PCR的成分 PCR的操作步骤,一、PCR的基本原理和步骤,基本原理DNA复制 碱基互补配对原则 A=T，G=C,一级结构的文字式缩写,基因 TGCAGGTTAAAGG 它的互补链: ACGTCCAATTTCC(误) CCTTTAACCTGCA(正) 3-ACGTCCAATTTCC-5(正),二、PCR的成分,模板 （Template DNA） 引物 （Primer） Taq DNA聚合酶 dNTP Taq聚合酶缓冲液 （Taq Buf
2、fer） 所有成分在同一离心管中,模板,是一段单链或者双链DNA，提供用于进行PCR扩增的原始信息 对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等 模板浓度过高会导致非特异性扩增增加 模板DNA应该尽量保持低温保存,引物,一段短的单链DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链 引物浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降 ；浓度过低产物量少,Taq DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物
3、、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。 必须一直保存于20，内含甘油保存 最适反应温度72 ，即延伸温度 在配制PCR体系的最后加 入 酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量,dNTP,脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dUTP等在内的统称，即合成新的DNA链的材料 4种dNTP 的浓度相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,Buffer,维持Taq酶扩增的最适条件和稳定性 Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活剂 过高: 非特异扩增增加 过低 : 使Taq酶活性丧失，反应产物减少,注意事项,所有的PCR体系都应该在-20
4、 保存 除了ddH2O之外，完全融化之后再加入，以免影响浓度 配制反应体系应在冰上操作或快速进行，以减少非特异性扩增 体系配制完成之后应马上进行PCR反应 分装处理，专人专用，防止交互污染,三、PCR的步骤,三个步骤,变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension)-Taq酶作用下，不断向引物3端添加DNTP，DNA链不断延伸,反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段： 变性94度，退火58度，延伸72度。,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DN
5、A双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,变 性,第一轮扩增,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,退 火,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,延 伸,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第
6、2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR的特点,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的反应体系,标准的PCR反应体系,10X 扩增缓冲液： 5l 模板DNA: 0.12g 引物： 各0.21mol/L 4种dNTP: 各200mol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U ddH2O 补齐 总体积： 50l,可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化 按照实验方案进行即可,PCR实验的设计,除实验样品外，每个PCR反应都必
7、须有阳性和阴性对照-针对模板 阳性：验证PCR反应体系和条件的正确性 阴性：验证PCR反应有无污染,PCR循环参数,（热力学参数）,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,94 ，3min； 94 ，45s； 58 ，1min； 循环30次 72 ，1min； 72 ，10min； 16 保温,94 预变性，3min 使DNA双链完全打开,退火： 58，1min 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。,变性： 94 变性，45s
8、 使双链DNA解链为单链,延伸：72 ，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 时间由扩增片段的长度决定 1min扩增1KB,循环次数： 主要取决于模板DNA的浓度 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,第二节 凝胶电泳 (gel electrophoresis),电泳概念 基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度,电泳的用途 分离 鉴定纯度 测定分子量 凝胶电泳的种类 琼脂糖凝胶电泳() 聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳 (agarose gel electrophoresis),分离核酸原理 操作要点 应用范围,（一）分离核酸原理,电荷
9、效应 分子筛效应 分子构象,1. 电荷效应,核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 pH = 8.08.3 , 负电荷，向正极移动 在电泳缓冲液中，DNA带负电荷，在电场作用下向正极移动 电泳不能使用蒸馏水，必须使用电泳缓冲液,2.分子筛效应,小分子移动快 ，大分子移动慢,3. 分子构象,闭环超螺旋线状DNA开环DNA,+,-,（二）操作要点,支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色,1. 支持物-琼脂糖,琼脂糖是由1，3连接的B-D-半乳呋喃糖和1，4连接的3，6脱水-L-半乳呋喃糖相间联结而成。琼脂中除琼脂糖外，尚含有琼脂糖果胶(Ag
10、aropectin)和丙酮酸等带电荷基团分子，在琼脂糖制备过程中尽可能地去除掉这些带电荷分子，以便获得品质优良的电荷中性产品。,商品化的琼脂糖,西班牙琼脂糖agrose与 细菌培养用琼脂agar的区别,2. 凝胶浓度的选择,凝胶的制备,注意：使用电泳缓冲液进行配制；加热过程中要不时摇动，使附着于壁上的琼脂糖颗粒进入溶液溶解。,3. DNA marker,上样3l，750bp条带为50ng，其它25ng,上样3l，500bp条带为50ng，其它25ng,DNA 长度标准曲线,4. 电泳缓冲液,Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE)
11、pH 8.0 凝胶制备时一定要使用电泳缓冲液,5. 样品制备,DNA 样品 每条带100ng 上样缓冲液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青 作用：上色；沉降,点 样,6.电泳条件,恒压电泳 低压: 12V/cm 中压: 810V/cm 高压：几十V/cm 温度：1525,7.电泳染色,溴化乙锭(ethidium bromide, EB) 荧光基团，在紫外光下显色,紫外灯下显色,Pipetman移液器（枪）的使用,法国Gilson,德国Eppendorf,芬兰 Dragon,工欲善其事必先利其器,根据实验需要选择合适量程的移液器,在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡内部机械装置
12、而损坏了移液枪。,卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈,用大拇指将按钮按下至第一档，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一档排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二档吹出残余的液体。最后先将移液器从液体中取出，后松开按钮。 注意按至吸液档时不要插入液面之下，否则会产生气泡。,吸液档（第一档）和放液档（第二档）,移液器的正确放置 使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。,用大量程的移液器移取小体积的液体 移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合准确度和精确度数值的要求,吸取具有强挥发性的液体 如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发,移液速度和放液速度过快 慢吸慢放，不会产生气泡，移液准确,细节决定成败！,知识回顾Knowledge Review,
