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1、核酸的性质核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。 一、一般物理性质 1. 溶解度 DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（12mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则
2、易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。 2. 分子大小 DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。核酸分子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基对）数目、沉降系数（S）和分子量等来表示。 3. 形状及粘度 核酸（特别是线形DNA）分子极为细长，其直径与长度之比可达1：107，因此核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。RNA溶液的粘度要小得多。核酸若发生变性或降解，其溶液的粘度降低。 二、核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有
3、紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白
4、及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1gmL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。通常以1OD值相当于50gmL双螺旋DNA，或40gmL单螺旋DNA（或RNA），或20gmL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴红染色而粗略地估计其含量。 三、核酸的沉降特性 溶液中的核酸分子在引力场中
5、可以下沉。不同构象的核酸（线形，开环，超螺旋结构）、蛋白质及其他杂质在超离心机的强大引力场中，沉降的速率有很大差异，所以可以用超离心法纯化核酸，或将不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸的沉降常数与分子量。 应用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸时，效果较好。RNA分离常用蔗糖梯度。分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。氯化铯在水中有很大的溶解度。可以制成浓度很高（8molL）的溶液。 应用啡啶溴红氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。如果应用垂直转头，当转速为65 000r/min（Beckman L-7
6、0超离心机），只要6h即可以完成分离工作。但是如果采用角转头，转速为45 000r/min时，则需36h。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚（图3-26）。蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。超螺旋DNA沉降较快，开环及线形DNA沉降较慢。用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA区带部位刺入，收集这一区带的DNA。用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除CsCl，再用苯酚抽提12次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。这样得到的DNA有很高的纯度， 可供DNA重组、测定序列及绘制限制酶图谱等。在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密
7、度梯度超离心分离。 四、核酸的两性解离及凝胶电泳 核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱性的碱基，故为两性电解质，可发生两性解离。但磷酸的酸性较强，在核酸中除末端磷酸基团外，所有形成磷酸二酯键的磷酸基团仍可解离出一个H+，其pK为1.5；而嘌呤和嘧啶碱基为含氮杂环，又有各种取代基，既有碱性解离又有酸性解离的性质，解离情况复杂，但总的来看，它们呈弱碱性。所以，核酸相当于多元酸，具有较强的酸性，当pK4时，磷酸基团全部解离，呈多阴离子状态。 核酸是具有较强的酸性的两性电解质，其解离状态随溶液的pH而改变。当核酸分子的酸性解离和碱性解离程度相等，所带的正电荷与负电荷相等，即成为两性离子，此时核酸溶
8、液的pH就称为等电点（isoelectric point, 简称pI）。核酸的等电点较低，如酵母RNA的pI为2.02.8。根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，把pH调至RNA的等电点，可使RNA从溶液中沉淀出来。 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是电泳（electrophoresis）。凝胶电泳可算是当前核酸研究中最常用的方法了。它有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的凝胶电泳有琼脂糖（agarose）凝胶电泳和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，
9、所以分离效率很高。 (一)琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素： 1. 核酸分子大小 迁移率与分子量对数成反比； 2. 胶浓度 迁移率与胶浓度成反比。常用1%胶分离DNA； 3DNA的构象 一般条件下超螺旋DNA的迁移率最快，线形DNA其次，开环形最慢。但在胶中加入过多的啡啶溴红时，上述分布次序会发生改变； 4电压 一般不大于5Vcm。在适当的电压差时，迁移率与电流大小成正比； 5碱基组成 有一定影响，但影响不大； 6温度 430都可，常在室温。 琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶（RNase）杂质，所以用于分析RNA时，必须加入蛋白质变
10、性剂，如甲醛等，以使核糖核酸酶变性。 电泳完毕后，将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染色（0.5gml）。啡啶溴红为一扁平分子，很易插入DNA中的碱基对之间。DNA与啡啶溴红结合后，经紫外光照射，可发射出红橙色可见荧光。0.1gDNA即可用此法检出，所以此法十分灵敏。可根据荧光强度可以大体判断DNA样品的浓度。若在同一胶上加一已知浓度的DNA作参考，则所测得的样品浓度更为准确。可以用灵敏度很高的负片将凝胶上所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下来，作进一步分析与长期保留。图3-27即为凝胶电泳图谱。 应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。实用的方法是在同一胶上加一已知分子量的样品（如图3
11、-27中的DNAHind的片段）。电泳完毕后，经啡啶溴红染色、照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。目前许多试剂公司都能提供各种不同分子量的标准样品。凝胶上的样品，还可以设法回收，以供进一步研究。回收的方法很多，可参考其他资料。最常用的方法是在紫外光照射下将胶上某一区带切割下来，切下的胶条放在透析袋中，装上电泳液，在水平电泳槽中进行电泳，使胶上的DNA释放出来并进一步粘在透析袋内壁上，电泳34小时后，将电极倒转，再通电3060s，粘在壁上的DNA重又释放到缓冲液中。取出透析袋内的缓冲液（丢弃胶条），用苯酚抽提12次，水相用乙醇沉
12、淀。这样回收的DNA纯度很高，可供进一步进行限制酶分析、序列分析或作末端标记。回收率在50%以上。 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。常用垂直板电泳。单体丙烯酰胺在加入交联剂后，就成聚丙烯酰胺。由于这种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分析分子量小于1 000bp的DNA片段。聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，所以可用于RNA的分析。但仍要留心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色，在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低的核酸样品不能用此法检测出来。 五、核酸的变性、复性 （一）变性 变性（denaturation）作用是核酸
13、的重要物化性质。核酸的变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链的无规则线团，使核酸的某些光学性质和流体力学性质发生改变，有时部分或全部生物活性丧失（图3-28），并不涉及共价键的断裂。多核苷酸骨架上共价键（3, 5-磷酸二酯键）的断裂称核酸的降解。降解引起核酸分子量降低。 当将DNA的稀盐溶液加热到80100时，双螺旋结构即发生解体，两条链分开，形成无规则线团。一系列物化性质也随之发生改变：粘度降低，浮力密度升高等，同时改变二级结构，有时可以失去部分或全部生物活性。 DNA变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积已不存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，这样就使得变性后的DNA对260nm紫外光的吸光率比变
14、性前明显升高（增加），这种现象称为增色效应（hyperchromic effect）。常用增色效应跟踪DNA的变性过程，了解DNA的变性程度。 可以引起核酸变性的因素很多，如加热、极端的pH、有机溶剂、酰胺、尿素等。由温度升高而引起的变性称热变性。由酸碱度改变引起的变性称酸碱变性。尿素是用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定DNA序列常用的变性剂。甲醛也常用于琼脂糖凝胶电泳法测定RNA的分子大小。 DNA变性的特点是爆发式的。当病毒或细菌DNA分子的溶液被缓慢加热进行DNA变性时，溶液的紫外吸收值在到达某温度时会突然迅速增加，并在一个很窄的温度范围内达到最高值。其紫外吸收增加40%，此时DNA变性发生并完
15、成。DNA热变性时，其紫外吸收值到达总增加值一半时的温度，称为DNA的变性温度。由于DNA变性过程犹如金属在熔点的熔解，所以DNA的变性温度亦称为该DNA的熔点或熔解温度（melting temperature），用Tm表示。DNA的Tm值一般在7085之间（图3-29），常在0.15mol/L NaCI，0.015mol/L柠檬酸三钠（sodium chloride-sodium citrate, SSC）溶液中进行测定。 DNA的Tm值大小与下列因素有关： 1 DNA的均一性 均一性愈高的DNA样品，熔解过程愈是发生在一个很小的温度范围内。 2 GC的含量 GC含量越高，Tm值越高，二者成
16、正比关系（图3-30）。这是因为GC对比A=T对更为稳定的缘故。所以测定Tm值可推算出GC对的含量。其经验公式为： GC% = （Tm 69.3）2.44 3 介质中的离子强度 一般说离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，熔解温度的范围较宽。而在较高的离子强度的介质中，情况则相反（图3-31）。所以DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液或溶液中。常在1molL NaCl中保存。RNA分子中有局部的双螺旋区，所以RNA也可发生变性，但Tm值较低，变性曲线也不那么陡。 （二）复性 变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合（reassociation）成为双螺旋结构的过程称为复性（renaturation）。DNA复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性也可以得到部分恢复。复性过程基
