《共聚焦激光扫描荧光显微镜--生化经典课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《共聚焦激光扫描荧光显微镜--生化经典课件（21页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、共聚焦激光扫描荧光显微镜, 基本原理、应用及样本制备原则,什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？ 共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM） 以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统,共聚焦系统 细胞CT,荧光和荧光显微镜,一、荧光的基础术语 荧光物质： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线 荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范
2、围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长),发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长) 荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体） 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理 漂白(BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 漂白。,二、荧光显微镜术的基本原理,荧光显微镜,激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490
3、长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490 双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490,共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置,共聚焦装置,光源 针孔,检测 针孔,荧光显微镜,光电倍增管,步进聚焦电机,物镜,Bio-Rad LaserSharp 系统操作，图像处理 3-D重建,X/Y扫描 装置,光电倍增管,检测针孔,光源针孔,光源,分色镜,物镜,样本,聚集平面,共聚焦扫描显微镜光学原理,检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 高分辨率的光学切片 激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准
4、的连续光学切片 实现三维重建,三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞,共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域,只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。 形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类 分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量：细胞内Ca+、K+、H+等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白,1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Re
5、cover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递,2. 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer),I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。,供体荧光素 受体荧光素,1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠,II.荧光能量共振转移的条件,488nm 520nm 650nm,供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),供体
6、荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP,Fluorescence Intensity,Time,检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。 应用 受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离 大分子构象的改变,III. 常用荧光共振转移探针对,3. 绿色荧光蛋白（GFP） GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水
7、母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。,GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒 转基因动物: Green mouse 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监测外源基因的表达. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成,原理: 检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可
8、进入细胞内, 被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。 Kd值：为Ca2+解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围: 0.1xKd-10xkd 和很多因素有关（pH、 Mg2+、温度、与蛋白的结合、等） 细胞内生理Ca2+浓度值：10-100nM 细胞内Ca2+超载浓度值：基础Ca2+浓度的10倍左右,4. 活细胞内离子动态变化测量,细胞内游离Ca2+测量,KCL诱导的细胞外Ca+内流测量,培养/分离的细胞 20M Fluo 3-AM负载液30-60min 清洗、换液 扫描,双光子激光扫描荧光显微系统,照射光波长大于荧光染料吸收峰波长2倍 高能量(2KW)、超短脉冲(兆分之一秒)聚焦,
9、使聚焦点瞬间产生高密度光子, 出现双光子吸收激发荧光 双光子吸收仅发生在聚焦点, 避免了焦点外激发而产生的漂白现象 高能量、超短脉冲聚焦、穿透性更强 50 m 500 m,488nm 520nm,FITC,976nm,共聚焦激光扫描荧光显微镜术样本制备的基本原则,2. 荧光探针的选择,原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。,3. 3-D样本制备的基本原则,1.固定 2.是否需要切片？ 激发光的穿透力：50um (单光子) - 500um (双光子) 荧光探针对组织的渗透能力 用震荡切片机切40-100m厚片 3.透明 酒精脱水 二甲苯透明 二甲苯+少量中性树胶湿封 4.封片： 防止样本变形 防止荧光褪色：封片剂：1）用PH8.5-9 PBS配制90%甘油，加苯二胺到 2mM -7mM ，调节 pH 不低于 8.5。2）Slow Fade （Molecular Probes）. 厚样本：大盖玻片,醛类：4%中性甲醛 结构保存好，但抗体渗透差；+ 0.1%Triton 有机溶剂：丙酮、甲醇 有利抗体渗透；部分抗原可能被抽提,三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞,
