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1、【摘要】 目的 探讨经不同剂量高能X线照射后食管癌患者血清可溶性MHC-I类分子链相关基因A (sMICA)含量、自然杀伤细胞(NK细胞)表面NK细胞2族成员D(NKG2D)受体的表达及其杀伤毒性的变化。方法 采用ELISA法检测中晚期食管癌患者(n=28)和正常对照(n=21)血清sMICA的含量，并动态分析6例食管癌患者经不同剂量高能X线照射后血清sMICA含量的变化。采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达，胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化。结果 与正常对照相比，食管癌患者血清sMICA含量明显升高，但不同放疗剂量对食管癌患者血清sMICA含量无显著影响。食管癌患者外周血
2、阳性表达NKG2D的NK细胞比例与正常对照相比显著降低，同时其细胞毒活性亦明显降低。而且与治疗前相比，4060 Gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加，同时其NK细胞毒活性最强。结论 放疗对食管癌患者血清sMICA含量无明显影响，但适量放疗可使NK细胞毒活性增强。 【关键词】 食管肿瘤;放射治疗;MHC-I类分子链相关基因A; 自然杀伤细胞Abstract:Objective To investigate the variations in the level of serum soluble MHC class I chain-related gene A (sMICA), the
3、expression of the surface receptor natural killer group 2 member D (NKG2D) on natural killer (NK) cells and the cytotoxicity of peripheral NK cells in esophageal cancer patients by irradiation.Methods The concentration of serum sMICA protein from medium and advanced esophageal cancer patients (n=28)
4、 and normal controls (n=21) were determined by ELISA, and the variations in the serum sMICA level were dynamically observed throughout the treatment with different doses of irradiation in 6 esophageal cancer patients. The NKG2D expression on NK cells were measured by flow cytometry, and the cytotoxi
5、city on target cells was evaluated by intracellular staining with perforin antibody.ResultsIn contrast to normal controls, serum sMICA level significantly increased in esophageal cancer patients; however, irradiation at different doses did not markedly affect the serum sMICA levels. The percentage o
6、f NKG2D-positive NK cells and their cytotoxicity significantly decreased. Furthermore, although there was no statistic variations in serum sMICA before and after irradiation, the percentage of NK cells and their cytotoxicity were enhanced at the irradiation dose of 40-60 Gy subsequent to the treatme
7、nt and meanwhile, the NK cell cytotoxicity was at its peak.Conclusions Irradiation has no direct effects on the serum sMICA levels, whereas irradiation at adequate doses will promote the cytotoxicity of NK cells.Key words： esophageal neoplasms; irradiation; MHC class I chain-related gene A; natural
8、killer cellsMHC-I类分子链相关基因A(MHC class I chain-related gene A, MICA)位于HLA-B位点上游约46 kb，其编码分子结构类似HLA-I类分子，但不与2微球蛋白结合，不递呈抗原肽。MICA主要表达于绝大多数肿瘤细胞、病毒感染的细胞、受诱导分化药物处理的细胞及射线照射引起DNA损伤的细胞，代表着机体的一种应激反应1。MICA通过与NK细胞、CD8+ T细胞表面的活化性受体NK细胞2族成员D(NKG2D)相结合，激活免疫系统而清除肿瘤及其他基因组损伤的细胞，在抗肿瘤和抗感染中发挥重要作用2。然而研究发现，肿瘤细胞表面的MICA分子可受到金
9、属蛋白酶的降解而成为可溶性分子(sMICA)，sMICA与NKG2D结合后促进了受体的内吞和降解，进而抑制NK细胞的功能3。在前列腺癌4、肠癌5、宫颈癌6及头颈癌7中均显示血清内sMICA含量与患者预后呈负相关。另外，我们的前期研究发现，放疗可促进食管癌细胞株ECA-109表达MICA分子8，但其是否对食管癌患者血清sMICA的含量产生影响，目前尚不清楚。研究发现，NKG2D是NK细胞表面重要的活化性受体，其表达量高低可反映NK细胞的活性状态9。在食管癌的放疗过程中，放疗剂量决定其局部肿瘤控制率，但过高剂量的照射往往损伤患者的免疫功能。因此本研究探讨食管癌患者在接受放疗时对血清sMICA含量、
10、NKG2D阳性表达的NK细胞比例及NK细胞毒功能的影响，从而深入了解食管癌患者放疗过程中患者体内NK细胞功能的变化，为进一步研究放疗联合免疫增强治疗提供理论依据。1 材料和方法1.1 试剂和药品 ELISA双抗体夹心法检测试剂盒，购自德国Immatics Biotechnologies公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，购自深圳晶美公司。淋巴细胞分离液购自上海生物工程公司;小牛血清和胎牛血清为杭州四季青公司产品; RPMI-1640培养基为Invitrogen公司产品;青霉素、链霉素、巯基乙醇为上海生物工程公司产品;K562细胞为本室常规保存;FITC-CD56单克隆抗体(mAb
11、)、PE-Cy5-穿孔素mAb、PE-NKG2D mAb购自eBioscience公司。1.2 分组 正常对照组：21例正常人，男12例，女9例，年龄1862岁。收集血清5 ml，其中11例同时收集外周抗凝血5 ml。食管癌组：28例中晚期食管癌患者 (均为食管病灶长度5 cm,未发现其他的转移灶)，男16例，女12例，年龄5178岁。1.3 方法1.3.1 直线加速器照射食管癌患者 所有食管癌患者予以瓦利安直线加速器6 MV X线进行放疗。放疗后收集血清5 ml，中25例同时收集外周抗凝血5 ml。另外，6例食管癌患者在治疗前、治疗剂量累计达2030 Gy及4060 Gy时均收集血清5 ml
12、、外周抗凝血5 ml。1.3.2 ELISA法检测血清sMICA浓度 双抗体夹心法，包被抗体为AMO1,检测抗体为BAMO3(针对MICA分子的3结构域)，酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠抗体。取标准品、患者血清、正常对照组血清及PBS各100 l加入各孔。封盖后37孵育2 h;冲洗3次，用试剂稀释液将检测抗体稀释成终浓度为400 g/L，各孔加入100 l，封盖37孵育2 h;冲洗3次，加酶，冲洗3次，加底物，当显色满意后每孔加入终止液(1 mol/L硫酸)50 l终止反应;轻拍使之混匀后立即上机检测，以450 nm读取光密度值。经标准品曲线拟合后获得每份标本中sMICA的含量。1.3.3 流式
13、细胞仪检测NKG2D的表达 取5 ml外周抗凝血，Ficoll常规分离外周血单个核细胞(PBMC)，分别用PE-NKG2D单抗、PE-Cy5-CD56单抗，FACS Aria流式细胞仪检测NKG2D阳性表达的NK细胞比例。1.3.4 NK细胞毒活性测定 当NK细胞杀伤靶细胞时，释放其细胞内的穿孔素，胞内染色法分析穿孔素阳性NK细胞减少的数量(即释放穿孔素的NK细胞)占总NK细胞的比例，可代表NK细胞的杀伤毒性。具体方法为：取外周抗凝血5 ml，Ficoll常规分离PBMC，与对数期K562细胞按101比例375%CO2孵育2 h，加入高尔基体阻断剂brefield A(BFA, 10 mg/L
14、)，4 h后按照eBioscience公司胞内染色法的操作说明标记NK细胞内的穿孔素。1.4 统计学处理 用Graphpad 4.0软件进行数据处理。组间血清sMICA含量、NKG2D阳性表达的NK细胞数、NK细胞毒活性的比较均用团体t检验。食管癌患者不同剂量照射后血清sMICA含量的变化用ANOVA方差分析和q检验。食管癌患者经不同剂量照射后NKG2D表达率、NK细胞功能的变化采用团体t检验。P0.05认为差异有显著性。2 结 果2.1 食管癌患者血清sMICA含量的变化 与正常对照组相比，食管癌组血清内sMICA含量显著升高(P0.05)。见表2。表2 不同放疗剂量对食管癌患者血清sMIC
15、A含量的影响2.3 食管癌患者外周血NK细胞NKG2D阳性表达率及NK细胞毒功能的变化 利用流式细胞术分析食管癌组和正常对照组外周血NK细胞表达NKG2D的阳性率，结果显示食管癌组NKG2D阳性率显著降低(P0.05)，见表3。同时利用胞内染色法分析NK细胞接触K562细胞时，释放穿孔素的NK细胞比例作为评价NK细胞杀伤毒性，比较2组NK细胞的杀伤毒性，发现食管癌组NK细胞毒性明显降低(P0.05),见表4。表3 2组NK细胞NKG2D阳性表达率的比表4 2组NK细胞杀伤毒性的比较2.4 4060 Gy的放疗剂量时NKG2D阳性表达率及NK细胞毒功能的变化 对6例食管癌患者动态检测其体内NKG2D的表达率及NK细胞毒功能，分别比较治疗前、2030 Gy和4060 Gy的治疗剂量时NKG2D阳性表达的NK细胞数，发现4060 Gy的治疗剂量时NKG2D表达率最高，与治疗前相比差异有显著性(P0.05)，见图1。与之对应的是，此时NK细胞杀伤毒性亦最高，与治疗前相比明显提高(P0.05)，见图2。3 讨 论我们采用回顾性研究的手段，不仅分析中晚期食管癌患者与正常个体血清内sMICA含量、N
