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1、,黑龙江生物科技职业学院,生物制药技术,生物分离技术,主讲人：张爱华,实训七、银耳多糖的制备及鉴定,实验原理,2,材料用具,3,操作方法,4,目的要求,2,1,5,5,注意事项,目的要求,了解银耳多糖制备的基本原理,掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术,原理,银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、 胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类， 不含核酸、蛋白质类物质。,可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提， 乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品， 再用CTAB (溴化十六烷基三甲铵)络合法 进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。,材料用具,银耳子实体干品（50g左右）,烧杯 、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏
2、斗、 量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋 、 滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。,试剂,（1）1复合酶制剂(含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶)； （2）2溴化十六烷基三甲铵（CTAB）配制： 取2 g CTAB溶于100 mL蒸馏水中，摇匀备用； （3）-萘酚配制：-萘酚5g溶于95乙 （4） 5%三氯乙酸-正丁醇溶液； （5）2molL的氢氧化钠溶液； （6）0.5甲苯胺乙醇溶液； （7）2molL氯化钠溶液； （8）2molL盐酸溶液； （9）活性炭；硅藻土。 （10）1融菌酶制剂； （11）无水乙醇； （12）浓硫酸； （13）乙醚。,操作方法,1.银耳预处理,20 g 锈钢锅中,加水
3、 1600 mL,2025 浸泡30min,捣碎机 中捣碎,银耳 浆液,操作方法,2molL盐酸溶液调pH至6.3,加 入 1 复 合 酶 制 剂,50下 酶促反应 40min,银耳 浆液,2.酶浸提,80灭酶， 保温浸提 约1.5h,80 水浴 浓缩,操作方法,等体积5三氯乙酸-正丁醇溶液,摇匀,离心 （3000r/min） 15 min,浓缩液,3.多糖的沉淀（有机酸除杂）,下层 清液 备用,吸去上层 正丁醇 中层 变性 蛋白,操作方法,2molL的氢氧化钠溶液调pH至7,摇匀,抽滤,3.多糖的沉淀（脱色、透析 ）,下层 清液 备用,加1活 性炭80 加热 15 min 脱色,滤液扎袋 流
4、水 透析12h,80水 浴浓缩 抽滤,操作方法,加3倍量95乙醇,摇匀,3.多糖的沉淀（乙醇沉析 ）,抽滤液,离心 （3000r/min） 15min,沉淀 用无水 乙醇洗 2次,乙醚 洗涤 1次,50 以下 真空 干燥,操作方法,4.精制（一）,取粗 品1 g,溶于100 mL水中,搅拌 静置 2h,2 CTAB,滤液,离心 除不溶物,60 解离 4 h,离心 3000r/min 15 min,80 热水 洗,氯 化 钠 2molL 溶 液 100 mL,操作方法,4.精制（二）,解离液,加 三 倍 量 95 乙 醇,透析液 80 浓缩,离心 3000r/min 15 min,精品 银耳 多
5、糖,离心 3000r/min 15 min,沉淀 用无水 乙醇、 乙醚 洗涤,上清液 流水 透析10h,50 真空 干燥,操作方法,5.多糖的鉴定（一）,观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化,透析液 1 mL,-萘酚溶液2滴,颜色变化,摇匀,沿管壁 缓加 入浓硫 酸 1.5 mL (勿振动),操作方法,5.多糖的鉴定（二）,透析 浓缩,透析 浓缩 2 mL,点于滤纸,0.5甲苯胺乙醇溶液染色,加入2CTAB溶液24滴,观察现象,注意事项,1.酶促反应的时间、温度应控制好。,2.在制备全流程中应时刻注意温度， 不能超过80,思考 题,1加入复合酶制剂有何作用？,2CTAB络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？,3为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过80？,
