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1、白芯片技术的基本原理,蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。,为了实现这个目的，首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上，同时能够维持蛋白质的天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物学活性。另外，由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性，开发和建立具有多样品并行处理
2、能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。,蛋白芯片技术的研究现状,日本学者Velev利用含有阳离子表面活性剂（HTAB）脂质体作为载体，通过戊二醛作用使其与一种铁蛋白包裹外壳的成分结合组装制备成为一种纳米水平的装配体，这种装配体可以在适当的pH条件下，使铁蛋白分子进入并固定于包裹外壳内面，形成蛋白质的载体。,Adachi等利用某些固体表面或薄膜覆盖上含有电解质的薄膜作为载体，可以将胶体蛋白质颗粒成分转移至薄膜上形成蛋白芯片。 Uetz等在分析啤酒酵母基因组序列全长度阅读框架编码各种蛋白质的相互作用的过程，使用不同孔数的平板作为载体，建立了约含有6000
3、个酵母转化株组成的平板蛋白芯片系统，平板上的每一个小孔中含有一个酵母转化株，可以根据其活性功能区开放阅读框架的编码表达生成一种蛋白质，利用这个系统可以用于蛋白质功能的检测和分析。,Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝胶板作为支持物，将蛋白样品置于凝胶上，然后经过电泳分离，使其成为蛋白的阵列用于进一步的研究。哈佛大学蛋白芯片研究中心Gavin等利用制备DNA芯片的高精密度机械手的针状点样枪头在只有显微镜载玻片一半大小的玻片上，制备了第一张含有样品点数为10800的蛋白芯片。这张芯片用已纯化的蛋白，按每点为1纳升的点样量点样10799次，,另一次用FRB（FK-BR12- rapamycin bind
4、ing domain of FKBP-rapamycin-associated protein）点样。为了确保不同分子量的点样蛋白质都能够被固定在玻片上，他们首先在玻片表面涂上BSA，然后使用N，N-二琥珀酰胺碳酸 （N，N-disuccinimidyl carbonate）激活BSA表面的赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基成为BSA-NHS玻片，其作用是促进BSA与点样蛋白质的结合而使蛋白质被固定于玻片上。,在制备芯片过程中，为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性，在蛋白质点样的磷酸盐缓冲液中加入40%的甘油，以防止因汽体的蒸发而造成的蛋白质变性。点样后再经3h的温浴并将芯片
5、浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的缓冲液中，使芯片表面含有一层小牛血清蛋白，用于封闭与其他蛋白质产生非特异性结合的部位及在表面未参加反应的醛基（封闭）。,为了检测芯片的应用，他们用不同荧光抗体分别标记能与蛋白G和FRB特异结合的IgG和 FKBP12（12Kd FK506-binding protein）并作用于蛋白芯片，观察这些蛋白质与蛋白芯片的相互作用，其结果清晰地显示芯片上的蛋白G和单一的FRB点样分别被标上蓝色和红色荧光。 该实验研究建立了蛋白质样品微量点样技术并使蛋白质固定于载体上时能够保留原有的构象和生物学活性，这将为今后对蛋白质多样品的并行研究或快速分析-为制备高通量功能检测的蛋
6、白芯片奠定了技术基础。,蛋白芯片的应用研究,Holt等利用蛋白芯片技术筛选能够相互结合的特异抗体抗原成分，他们利用12种表达较强但尚未接触任何抗原的抗体片段筛选含有27648种人胎脑蛋白的蛋白芯片，从中找出了4组高度特异性的抗原（蛋白）-抗体复合物，其中有3种抗体结合的蛋白质功能未明，但是由于表达水平都较低，说明这种抗原-抗体的结合技术是一种具有较高特异性和敏感性的筛选方法，可以用于高通量筛选分离各种不同的抗体成分，或检测基因的表达和蛋白分子间的相互作用，这将有助于对某些疾病（包括肿瘤） 的发病分子机理的研究，以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子。根据蛋白芯片技术的基本原理，可以将不同的抗体固定
7、于载体上成为抗体蛋白芯片，用于检测不同组织产生的蛋白质。,Ge在蛋白质的相互作用的研究中，采用了一种通用的蛋白质芯片系统，该系统敏感有效，用途广泛，可定量测定及重复使用， 而且操作简易。 Gavin等应用蛋白芯片技术观察代谢过程有关作用物和酶的相互作用关系。他们选择三对激酶-作用物系统，即依赖3，5-磷酸蛋白激酶-Kemptide； 蛋白激酶-蛋白质磷酸酶抑制因子2和p42促有丝分裂激活蛋白（MAP）激酶（ErK2）-E1K1，首先将各系统的作用物按顺序固定于三张 BSA-NHS玻片上，分别在有同位素-33P ATP的环境中，与不同蛋白激酶温浴，然后，玻片经用乳剂处理后可在光镜下观察到各种蛋白
8、激酶催化特异的作用物产生磷酸化反应。其结果提示蛋白芯片技术可以应用于作用物与酶相互作用的研究及代谢机制的分析。,Gavin等还在蛋白芯片技术研究过程通过DIG、生物素和合成的六氢吡喧酮胺（即AP1497）等三种具有对应的蛋白受体的小分子特质，研究蛋白的受体蛋白按顺序固定的相互作用。他们首先将三种小分子物质的受体蛋白按顺序固定于同一载体上并制备成为相同的四张蛋白芯片，将BSA分别用荧光物质（Alexa488、Cy3或Cy5）标记，并分与DIG、生物素和AP1497三种小分子物质结合成为探 针，用每一种具有不同荧光标记的探针作用芯片，结果只有能与小分子对应的受体蛋白被标上荧光。上述结果说明使用的荧
9、光剂之间没有交叉的荧光激发和发光 作用，因此，将三种标记探针混合后作用于蛋白芯片，则可使三种不同的受体蛋白同时标记上不同的荧光。研究结果提示蛋白芯片技术对于新药的发掘是十分有用的，因为它对寻找新药作用的靶点非常方便。,存在的问题及应用前景,虽然目前已经成功地制出了第一张具有高通量分析作用的蛋白芯片，通过适当的技术处理可以使点样蛋白保持天然的构象和生物学活性。但是，利用蛋白芯片技术对于蛋白质功能的研究仍然存在着种种问题，例如目前大多数来自于cDNA文库的克隆体系不能通过正确的阅读框架编码蛋白质；或者不能正确表达产生具有氨基酸全序列的蛋白分子；通过细菌表达的蛋白质不能形成正常的空间构象等，都将直接
10、影响有关蛋白质功能的研究。另外，为了方便种类繁多的蛋白质的功能检测和分析，通过不同途径或方式获取并用于制作蛋白芯片的蛋白质必须首先经过纯化。正常和异常情况下蛋白质与蛋白质之间的相互作用的差别都需要我们进一步去探索。,高通量分析平台蛋白芯片技术的建立将为蛋白质功能及其相关的研究提供快速、高信息量和更为直接的研究方法，与其他的分子生物学分析方法相比，蛋白芯片技术具有快速、平行的优越性。该方法的建立和应用将有助于人类揭示疾病发生的分子机制及寻找更为合理有效的治疗手段和途径。,蛋白质芯片的意义,1、蛋白质是基因表达的最终产物，接近生命活动的物质层面； 2、探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理
11、，甚至可直接利用生物材料（血样、尿样、细胞及组织等）进行检测； 3、适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物； 4、有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。,蛋白质芯片的分类：,1、蛋白质检测芯片； 2、蛋白质功能芯片。,蛋白质芯片的制备,1、固相载体及其处理（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）； 2、蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解； 3、点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等； 4、膜为载体：芯片放入湿盒，371h；载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白； 5、微阵列的封闭固定微阵列上的蛋白样点，主要封闭试剂：BSA或Gly。,液相蛋白芯片技术及
12、其应用进展,液相蛋白芯片技术由美国Luminex公司研制开发并于2O世纪9O年代中期发展起来，是在流式细胞技术、酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技术和传统芯片技术基础上开发的新一代生物芯片技术和新型蛋白质研究平台。液相蛋白芯片技术推动了功能基因组时代的蛋白质研究， 相关的仪器、分析软件以及试剂盒研发备受瞩目并已形成一定的市场规模。,液相蛋白芯片技术的基本原理,液相芯片技术在国际上被称之为xMAP(flexible MultilyteProfiling)技术，其核心技术是乳胶微球包被、荧光编码以及液相分子杂交。液相芯片体系以聚苯
13、乙烯微球(beads)为基质， 微球悬浮于液相体系，每种微球可根据不同研究目的标定上特定抗体或受体探针，可对同一样品中多个不同的分子同时进行检测。微球表面可进行一系列修饰以适合固定各种蛋白、多肽或核酸等生物分子。xMAP技术可应用于蛋白或核酸的功能及其相互作用研究，分别称之为液相蛋白芯片技术和液相基因芯片技术。,液相蛋白芯片体系主要包括微球、蛋白探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有独特的色彩编码，其原理是在微球中掺入不同比例的红色分类荧光及发色剂，可产生100种颜色差别的微球，可标记上100种探针分子，能同时对一个样品中多达10
14、0种不同目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。结合反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。,液相蛋白芯片技术的特点,液相蛋白芯片技术有机地整合了微球、激光检测技术、流体动力学、高速的数字信号处理系统和计算机运算功能，不仅检测速度极快，而且在免疫诊断以及蛋白质分子相互作用分析方面，其特异性和敏感性往往也超越常规技术。,1、 反应快速，灵敏度高。反应环境为液相、微球上固定的探针与待检样品均在溶液中反应，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或ElISA等反
15、应模式，可增加 1O倍以上，因此可提高反应速度及灵敏度。抗原一抗体等蛋白质分子相互作用的结果可在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来，敏感性显著超越酶联信号或常规杂交信号检测。,2、通量大，可同时检测多种目标物，所需成本较低，减少人力消耗，可对同一样品中多达100种分子同时进行分析。液相芯片系统采用96孔板为反应容器，在35-60min内，可对96个不同的样品进行检测，所需样品用量比常规方法少。 3、可进行多元化分析，灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，应用广泛。通过对微球表面的修饰，可固定各种抗体或受体分子，从而满足不同检测和功能的研究需要。,4、采用接近生物系统内部环境的完全液相反
16、应体系，稳定性好。液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，不仅有利于探针和被检测物的反应，也更能保证反应的特异性和稳定性。 5、操作简便，不需洗涤，耗时短。常规ELISA或固相芯片技术，每一步反应之后都需充分洗涤以去除非特异结合成分，耗时且易造成污染。而液相芯片技术可以避免这些过程和弊端。,蛋白芯片在免疫诊断和分析领域的应用,蛋白芯片系统适用于蛋白质组学研究，临床研究和药物研究中的各种蛋白质分析，已被应用于细胞因子和激酶的检测、抗原决定簇的筛选、多种蛋白质过敏原检测、传染病快速诊断以及与各种抗原、抗体反应相关的检测当中。在免疫诊断与分析研究应用方面，全球已有上百篇公开发表的论文和研究报道，主要可归纳为以下几方面。,1、传染病的快速检测和疾病诊断：xMAP液相蛋白芯片免疫诊断方法又称为微球免疫方法(micro-sphere immunoassay)，国内外已建立多种微球免疫方法用于人和动物传染病快速检测以及人类疾病诊断研究。,Yan 等建立微球免疫检测方法进行流感病毒检测和分型，并与EusA方法比较，结果表明微球免疫法对流感病毒粒子和重组血凝素抗原的检测敏感性均提高了10倍
