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1、三、 基因重组蛋白包涵体的分离和复性,外源基因在大肠杆菌中的表达形式,位于,细胞质,细胞周质,细胞外,表达产物,形式,包涵体蛋白,融合蛋白,整合型外源蛋白,分泌型外源蛋白,细胞质中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会 发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。 包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚 集折叠而成的晶体结构物。,包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋
2、白从细 菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白 。,包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能得到有正确空间构象的目标蛋白。 体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。,包涵体直径约0.5-1m，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。,包涵体加工流程,离心,去除细胞碎片 （ 膜蛋白和脂类等）,机械破碎法,包涵体提取,如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化经常面临
3、的一个难题,包涵体的洗涤,为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如2mol/L尿素或盐酸胍等，洗涤以除去脂类和膜蛋白。 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA,包涵体的溶解,大多数在pH8的条件下，用强变性剂如8mol/L尿素、 6mol/L盐酸胍，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展,对于含有S-S的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键 为将包涵体充分溶解，需加入还原剂（如二硫苏糖醇 DTT、GSH、巯基乙醇 -ME）打开
4、蛋白质中所有二硫键，一般是50-100mM -ME或DTT（对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，因为含S-S的杂蛋白会影响包涵体的溶解）,同时还应加入金属螯合剂，如EDTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子，防止已经处于还原状态的SH-与之发生氧化反应。,包涵体溶解后，蛋白质成为失去了生物学活性伸展肽链,蛋白质复性机理,蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用： 一是分子内的疏水相互作用 促使蛋白质正确折叠 二是肽链分子间的疏水相互作用导致蛋白质分子间聚集，形成寡聚体和多聚体再进一步聚集形成沉淀,两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提
5、高复性收率的关键。,伸展态U,中间体I,聚集体A,天然态N,快,慢,一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右,复性常用方法,1. 稀释复性： 直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。,2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作。 3. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上）。,4. 色谱复性：兼具分离。 4.1 凝胶过滤复性： 该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂
6、脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。,4.2吸附型层析复性： 原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。,四、重组蛋白质的鉴定,测定蛋白质的浓度 凯氏定氮法 紫外吸收法 分光光度法 测定蛋白质的纯度 鉴定目标蛋白质 蛋白质分子质量与等电点的测定 氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质活性及功能测定,1 蛋白质含量的测定,凯氏定氮法： 蛋白质平均含氮量为16，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量。 紫外吸收法 芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260
7、nm附近有最大光吸收. 经验公式 蛋白质含量（mg/mL）=1.45 A 280nm 0.74A 260nm 分光光度法 蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定的波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量 考马斯亮兰法等,2. 纯度鉴定,鉴定方法 色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰 电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带 结晶纯：能够获得蛋白质晶体 相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此需要互相验证。,色谱纯,电泳纯,结晶纯,3.蛋白质鉴定,分子质量及等电点测定 氨基酸组成及顺序分析 结晶及结构分析 免疫印迹（wester
8、n-blotting）鉴定,3.1蛋白质分子质量及等电点的测定,分子质量 SDS-PAGE PAGE 等电点 等电聚焦（IEF）,3.2氨基酸组成及顺序分析,氨基酸组成 水解蛋白质为氨基酸 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定 顺序分析 质谱法 推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列 化学法（手工、自动） 水解法 Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法,各类氨基酸自动测序仪,3.3 空间结构分析,二级结构的比例 圆二色谱法 三维结构 X射线晶体衍射法蛋白质晶体 核磁共振溶液中蛋白质的三维结构 电子显微镜,3.4 免疫印迹鉴定,免疫印迹包括三个步骤 凝胶电泳 转膜 抗原抗体显色反应,原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法,检测项目,检测方法,产品是否含内毒素 家兔热原法,蛋白质是否变异 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳,甲硫氨酸是否被甲酰化 肽谱、质谱、HPLC、Edman分析,蛋白质是否变性、聚合、脱氨基 SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质,配体是否脱落 SDS-PAGE、免疫分析,氨基酸是否发生取代 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳,产品是否被细菌、病毒、支原体等污染 微生物学检测,谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析,OVer!,
