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1、微生物遗传与育种复习资料1、 第二章 基因突变及其机制1.1染色体畸变和基因突变的不同？答：染色体畸变指染色体结构的改变，由于染色体断裂、重新排列而产生的染色体的缺失、重复、倒位、易位，往往涉及多个基因。 基因突变是指一个基因内部的遗传结构或 DNA 序列的改变， 由于一对或少数几个核苷酸的缺失、插入或置换而产生的碱基置换、移码突变。通常只涉及一个基因。 染色体畸变是发生在染色体水平的突变，基因突变是发生在基因水平的突变。 染色体畸变涉及到DNA分子上较大的变化，有可能使细胞致死。基因突变一般只涉及DNA上一对或几个核苷酸的缺失。1.2化学诱变剂的种类、适用范围及如何终止反应？答：碱基类似物（
2、5-溴尿嘧啶（5-BU）诱发ATGC GCAT更容易 2-氨基嘌呤（2-AP）诱发ATGC ATGC更容易 ）一般要经过两轮复制才能形成稳定的可遗传突变。只对生长的微生物起作用，对静止的细胞如细胞悬液、孢子悬液、芽孢悬液不起作用。可通过从含有碱基类似物的培养基中挑取菌落移植到正常培养基中培养终止反应。 碱基修饰剂（脱氨剂如HNO2诱发ATGC 还可以氨基的交联作用 羟化剂 如羟胺 诱发GCAT）可以通过改变pH终止反应。 移码突变剂（吖啶类染料 溴化乙锭 ICR 类化合物）移码诱变剂的嵌入并不导致突变，必须通过 DNA的复制才能够形成突变，因此只能用于生长态细胞。可通过从含移码突变剂的培养基中
3、挑取菌落移植到正常培养基中培养终止反应。1.3紫外线的诱变机制及操作方法？答：诱变机制：DNA 分子尤其是嘧啶强烈吸收紫外线，造成相邻的胸腺嘧啶形成稳定的二聚体（T=T） T与T 之间形成化学键连接，对热和酸都稳定DNA 分子在复制时，两条链之间的 T=T 会阻碍双链的分开，导致复制无法正常进行同一条链上的 T=T 会阻止 A 的正常掺入，导致复制停止或错误进行，最终形成突变。操作方法：取已培养好的新鲜斜面菌种，用无菌生理盐水洗下，接于盛有玻璃珠的100毫升三角瓶中，充分摇动10分钟，使菌体均匀分散，用滤纸过滤，即为菌悬液取上述菌悬浮液计数，调整菌悬浮液密度为108 个/毫升， 吸取 1 毫升
4、菌悬浮液于 9 毫升无菌水中，稀释后再计数一次，取3ml至平皿中照射处理前，先开紫外线灯20分钟，使灯的功率稳定（如灯的功率为15瓦，则照射距离为1530厘米，灯的功率为30瓦，则照射距离为3050厘米）将待处理的菌悬液放于培养皿中，置于电磁搅拌器上，放在紫外线灯正中下方，先将整个平皿照射1分钟后，打开皿盖，此时开始记时并启动电磁搅拌器，准确计算照射时间。1.4 DNA的修复？答：复制修饰系统（I、DNA 聚合酶的校读功能。II、N-糖基酶修复系统。III、错配修复系统）损伤修复（I、光复活。II、切除修复。III、重组修复IV、SOS修复系统（唯一一个导致突变的修复）。）2、 第三章 工业微
5、生物生产菌的分离筛选 2.1从土壤中取样的方法？答：将表层 5cm 左右的浮土除去 取 5 25 cm 处的土样 1025g，装入事先准备的塑料袋内扎好 给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件 将土样去除石块、草根，在无菌研钵中研磨压碎，称取5g 加入含 45ml 无菌水的三角瓶，振荡 10min 静置30s，的 10-1 土壤悬液 取 4 支装有9ml无菌水的试管，依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5的菌悬液 取10-5、10-4、10-3菌悬液各0.5ml，涂布于培养基表面，每个浓度梯度涂布3块平板。 2.2如何选择采样地点及时间？答：（一）、根据微生物
6、的营养类型（如森林土 富含纤维素，能分离纤维素酶的生产菌； 肉类加工厂和饭店排水沟附近的土壤 能分离到蛋白酶和脂肪酶的生产菌； 面粉厂、糕点厂、淀粉加工厂及酒厂附近的土壤 能分离到淀粉酶、糖化酶的生产菌） （二）、根据微生物的生理特征（如筛选高温菌 到温泉、火山口等地采集；筛选低温菌 到南北极、冰窖、深海等初采；耐压菌 到深海采集耐高渗透压菌 到甜果、花蜜、蜜饯等处采集）秋季土壤中的微生物种类和数量最多，为最佳采样时间。2.3厌氧微生物的分离？答：1、加还原剂分离培养基内加入还原剂，如半胱氨酸、D型维生素、硫化钠 等 快速划线分离 立刻置于事先抽真空的容器，或事先充满 CO2、N2 的密闭容器
7、中适温培养2、焦性没食子酸法先将焦性没食子酸放在容器内 将含有厌氧菌的培养皿架空放入容器内 加入 NaOH 溶液 立即盖上盖子，并用凡士林密封，适温培养3、平皿厌气培养法取一套无菌培养皿，在皿盖上倒入分离培养基，凝固后，在皿底一侧放焦性没食子酸固体，另一侧放 10% NaOH，二者不混 快速将样品液在分离培养基上划线，盖上皿盖并密封 摇动平皿，是焦性没食子酸和 NaOH 混合发生化学反应，出去皿中的氧气，适温培养。2.4菌种分类鉴定主要步骤 ？答： 对要鉴定的菌株进行纯化。 测定一系列必要指标（包括细胞形态和习性：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等。细胞组分水平:细胞成分、氨基酸库、
8、脂类、醌类、光合色素等分析。蛋白质水平:氨基酸序列分析、凝胶电泳分析和血清学反应等。基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol % 、转化和转导16SRNA寡核苷酸序列分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等） 查找权威鉴定手册（1. 原核生物分类系统（伯杰氏系统细菌学手册）2. 真菌界分类系统很多，较多人接受的是Ainsworth的纲要。3.微生物数码分类表（统计分类法） ）3、 第四章 工业微生物菌种复壮与保藏3.1菌种退化的原因？答：基因突变导致菌种退化的主要原因。质粒丢失。连续传代 加速菌种退化的直接原因。培养和保藏条件的影响。3.2菌种退化的防止？答：尽量减少传代。菌种经常纯化。创
9、造良好的培养条件。用单核细胞移植传代。采用有效的菌种保藏方法。3.3菌种复壮的主要方法.答：纯种分离淘汰法淘汰已衰退的个体，如采用 -10-30 处理产放线菌素的Streptomyces microflauus的分生孢子57 天，死亡率 80%，存活下来的是未退化的健壮个体，达到复壮的目的。宿主体内复壮法对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种相应的昆虫等动、植物体内的措施来提高他们的活性。3.4菌种保藏的原理、步骤及条件？答：原理：根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥
10、、缺氧、缺乏营养 能抑制微生物的代谢作用。步骤：1.挑选特征典型的纯菌菌落2、确定保藏的合适菌体形态 最好是休眠体如分生孢子、芽孢等3、选择最适宜的保藏方法4. 定期对所保藏的菌种进行检查，观察其是否出现变化，如果出现变化，必须改变保藏方法5、保藏期满应及时进行移种条件：A、干燥 B、低温 C、缺氧 D、避光 E、缺乏营养 F、添加保护剂、酸度调节剂。3.5菌种保藏的方法？答：1、斜面保藏法（一般置于4 保藏，13个月移接一次，继续保藏）2、液体石蜡油保藏法（一般置于4 保藏，35年传代一次）3、干燥保藏法（针对会产生孢子的放线菌、霉菌以及能产生芽孢的细菌，孢子或芽孢在干燥环境中抵抗力强，处于
11、休眠状态，不易死亡，可保藏 25 年，有的甚至长达 20 年）4、冷冻干燥保藏法（可保藏 510 年）5、真空干燥法6、液氮超低温保藏法（保藏时间最长）7、液相保藏法8、工程菌的保藏注：大家选择一种保藏方法并记住其步骤。4、 第五章 基因突变的应用4.1诱变育种的一般过程？ 答： 出发菌株的选择 原种特征考察 摇瓶初筛 摇瓶培养(活化和同步培养) 对照组 挑选高产菌株菌种保藏 制备单孢子或单细胞悬液 活菌计数 传种斜面活化 诱变培养 活菌计数,计算致死率 摇瓶复筛(可反复进行多次) 后培养 对照组 挑选高产菌株 稀释涂布平板 进行稳定性试验和菌种特性考察优化培养条件平板预筛,挑取单菌落接种斜面
12、,观察并记录其形态特点 发酵罐中试,终筛优化培养条件 大规模生产放大试验 进一步诱变注：具体问题结合上述过程回答。4.2出发菌的选择要求？答：1、尽量选择既往诱变史少的高产菌株2、挑选纯系菌株3、选择对诱变剂敏感的菌株4、选择单倍体的单核细胞5、采用多出发菌株 在不了解出发菌株对诱变菌敏感性的情况下，可考虑6、更换出发菌株 当某一选育谱系经过长期诱变处理效果不理想时，可考虑4.3诱变剂的选择要求？答：A、尽量选择毒性小、易于防护、安全性强的诱变剂B、尽量选择操作简便易行、便宜易得到诱变剂C、尽量选择不易发生回复突变的诱变剂D、在反复使用同一诱变剂进行长期诱变处理后，应换其他诱变剂进行处理4.3
13、采用紫外线与光复合复合处理的原因？答：通过光复活酶的修复作用，导致嘧啶二聚体解体恢复原来的 DNA 结构，甚至一些接近死亡的菌体也会恢复基本的生活能力，但它们中的某些代谢失调现象不一定能得到调整，即群体中那些突变体将保留下来，提高了突变率。4.4琼脂块大通量筛选突变菌株的一般过程？答：将诱变后的菌悬液涂布培养，每皿控制 3050个菌落，适温培养到刚刚长出针尖样菌落 还未产生抗生素或酶 用内径为 6mm 的打孔器，将菌落连同下面的琼脂培养基一起取出，转移到无菌的空白平皿内适温培养到所有菌落的产物达到高峰期，将琼脂块移到检定板上，温育，测定并比较形成的抑菌圈或水解圈的大小，挑出高产菌株（可淘汰95%的低产菌株）4.5检出营养缺陷突变菌株的方法？答：、逐个检出法 将处理液在 CM 平板上培养分离 将菌落用无菌牙签一一对
