《控制菌检查法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《控制菌检查法（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三次公示稿 1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 供试品检出控制菌或其他致病菌时 ,按一次检出结果为准 ,不再复试。 供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则 1105） ” 。 如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂， 应确认其对微生物无毒性以及与
2、所使用中和剂或灭活剂的相容性。 培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验 供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验， 以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时， 控制菌检查方法应重新进行适用性试验。 菌种及菌液制备 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过 5 代 （从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)CMCC（B）26 003 铜绿假单胞菌( Pseudomona
3、s aeruginosa)CMCC（B）10 104 大肠埃希菌( Escherichia coli)CMCC（B）44 102 乙型副伤寒沙门菌( Salmonellaparatyphi B)CMCC（B）50 094 白色念珠菌( Candida albicans)CMCC（F）98 001 生孢梭菌（ Clostridium sporogenes） CMCC（B）64 941 第三次公示稿 菌液制备 将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，3035培养1824 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖
4、液体培养基中，2025培养 23 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下3035培养24 48小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中3035培养 1824 小时。上述培养物用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 28，可在24 小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用。 阴性对照 为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验， 阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 培养基适用性检查 控制菌检查用的成品培
5、养基、 由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。 控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。各培养基的检查项目及所用的菌株见表 1。 表 1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性 控制菌检查 培养基 特性 试验菌株 肠道菌增菌液体培养基 促生长能力 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 耐胆盐革兰阴性菌 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 促生长能力+指示特性 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 麦康凯液体培养基 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 麦康凯琼脂培养基 促生长能力+指示特性 大肠埃希菌 第三次
6、公示稿 RV 沙门菌增菌液体培养基 促生长能力 乙型副伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 促生长能力+指示特性 乙型副伤寒沙门菌 沙门菌 三糖铁琼脂培养基 指示能力 乙型副伤寒沙门菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 促生长能力 铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌 抑制能力 大肠埃希菌 甘露醇氯化钠琼脂培养基 促生长能力+指示特性 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 抑制能力 大肠埃希菌 梭菌增菌培养基 促生长能力 生孢梭菌 梭菌 哥伦比亚琼脂培养基 促生长能力 生孢梭菌 沙氏葡萄糖液体培养基 促生长能力 白色念珠菌 沙氏葡萄糖琼脂培养基 促生长能力+指示特性 白色念珠菌 促
7、生长能力+指示能力 白色念珠菌 白色念珠菌 念珠菌显色培养基 抑制能力 大肠埃希菌 液体培养基促生长能力检查 分别接种不大于 100cfu 的试验菌（见表 1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 固体培养基促生长能力检查 用涂布法分别接种不大于 100cfu 的试验菌 （见表 1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。 培养基抑制能力检查 接种不少于 100cfu 的试验菌（
8、见表 1）于被检培养基第三次公示稿 和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。 培养基指示特性检查 用涂布法分别接种不大于 100cfu 的试验菌（见表 1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 控制菌检查方法适用性试验 供试液制备 按下列“供试品检查”中的规定制备供试液。 试验菌 根据各品种项下微生物限度标准中规 定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时, 采用大肠埃希菌和铜绿
9、假单胞菌为试验菌。 适用性试验 按控制菌检查法取规定量供试液及不大于 100cfu 的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,在最后一次冲洗液中加入试验菌,过滤后, 注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。 结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性（见非无菌产品微生物检查：微生物计数法（通则 1105）中的“抗菌活性的去除或灭活” ） ，并重新进行方法适用性试验。 如果经过试验确证供试品对试验
10、菌的抗菌作用无法消除， 可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中， 选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。 供试品检查 供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。 阳性对照试验 阳性对照试验方法同供试品的控 制菌检查,对照菌的加量应不大于 100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 第三次公示稿 耐胆盐革兰阴性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria) 供试液制备和预培养 取供试品， 用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释
11、剂照 “非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液，混匀，在 2025培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约 2小时） 。 定性 试验 除另有规定外，取相当于 1g 或 1mL 供试品的上述预培养物接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，3035培养 2448 小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，3035培养 1824 小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。 定量试验 选择和分离培养 取相当于 0.1g、0.01g 和 0.001g（或 0.1mL、0.01mL 和0.001mL）供
12、试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，3035培养 2448 小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，3035培养 1824 小时。 结果判断 若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长， 则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表 2 查 1g 或 1ml 供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。 表 2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N） 各供试品量的检查结果 0.1g或0.1ml 0.01g 或 0.001g 或每 1g(或 1mL)供试品中可能的菌数 cfu N103 102N103 10N10
13、2 N10 注： 代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上 无菌落生长。 第三次公示稿 若供试品量减少 10 倍（如 0.01g 或 0.01ml，0.00 1g 或 0.001ml，0.0001g 或 0.0001ml） ，则每 1g(或 1mL)供试品中可能的菌数（N）应相应增加 10 倍。 大肠埃希菌( Escherichia coli) 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液。取相当于 1g 或 1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基
14、中，混匀，3035培养 1824 小时。 选择和分离培养 取上述培养物 1mL 接种至 100mL 麦康凯液体培养基中，4244培养 2448 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养 1872 小时。 结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。 沙门菌（ Salmonella） 供试液制备和增菌培养 取 10g 或 10mL 供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确定） 的胰酪大豆胨液体培养基中
15、， 混匀， 3035培养 1824 小时。 选择和分离培养 取上述培养物 0.1mL 接种至 10mL RV 沙门增菌液体培养基中，3035培养 1824 小时。取少量 RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035培养 1848 小时。 沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养 1824 小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。 结果判断 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色
16、、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。 第三次公示稿 铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa） 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液。取相当于 1g 或 1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。3035培养 1824 小时。 选择和分离培养 取上述培养物划线接种于溴化十六烷
