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1、? ? 作者单位: 200040? 上海, 复旦大学附属华山医院血液科 血小板自身抗体的流式细胞检测与意义 吴蓓倩 ? 朱 ? 萍 ? 牛 ? 强 ? 陈 ? 字 ? 谢? 毅 摘? 要? 目的? 应用流式细胞仪 (FCM )检测血小板抗体, 研究其正常参考值及对特发性血小板减少性紫癜 ( I TP)诊断的价 值。方法? 应用 FCM 检测 20例正常人和 10例 ITP患者血小板表面抗血小板抗体, 并与酶联免疫竞争抑制试验 ( ELISA法 )进行 比较。结果 ? FCM 检测 20例正常人血小板表面 IgG、IgA和 Ig M 的荧光百分率分别为 2?56? 2?08% 、 13?75?
2、5?98% and 13?90? 7?28% ; I TP患者血小板表面 IgG、IgA和 Ig M 荧光百分率分别为 28?13? 17?74% 、 25?07? 16?84 % 和 23?22? 17?85% 。结论? FCM 对于检测血小板表面血小板相关抗体是快速、 敏感的新方法, 优于 ELISA方法。 关键词? 流式细胞仪? 血小板抗体? 特发性血小板减少性紫癜 Flow Cytom etry Detection ofPlateletAssociated Antibody in Patients with Idiopathic Thrombocytopenic Pupura . ?W
3、u Beiqian, Zhu Ping, N iu Qiang, Chen Zi, X ie Yi. H ematology Depart ment, HuashanHospital, Fudan University, Shanghai200040, China Abstract ?Objective? To set up amethod ofdetecting platelet associated antibody( PA Ig) by flow cytometry ( FCM ), and to inves? tigate the value ofFCM method in the d
4、iagnosis of idiopathic thrombocytopenic purpura ( ITP). M ethods? W e detected the plateletassoci ? ated antibody of20 healthy donors and 10 patientswith I TP . These sampleswere alsomeasuredw ith ELISA. The results ofFCM were co m? pared with the results ofELISA. Results?By FCM, the measured value
5、of PA IgG, PA IgA and PA Ig M, from 20 normal dornors , were 2?56? 2?08 % 、 13?75 ? 5?98%and 13?90? 7?28% , respectively . In patients w ith I TP, PA IgG, PA Ig A and PA Ig M were 28?13 ? 17?74% 、 25?07? 16?84 %and 23?22? 17?85% . Conclusion?FCM can be a rapid, sensitive and new method in detecting
6、platelet au? toantibody , and has better potential than ELISA. K ey words? F low cyto metry ; Platelet associated antibody ;Idiopathic thro mbocytopenic purpura ? 特发性血小板减少性紫癜 ( I TP)是由于患者体内 产生抗血小板抗体与血小板结合后导致了血小板被自 身破坏。血小板自身抗体的检测对于 I TP的诊断和治 疗有重要意义。我们建立了 FCM检测血小板自身抗 体的方法, 并与酶联免疫竞争抑制试验 ( ELISA法 )做 了初步
7、比较, 探讨其对 I TP诊断的价值。 资料与方法 1. 研究对象: 正常对照组为正常献血员, 共 20例, 其中男性 8 例、 女性 12例, 年龄 22至 40岁。 I TP病人 10例, 男性 4例, 女性 6 例, 年龄 20 77岁, 其中 I TP10例, 均符合国内诊断标准 1。 2?主要仪器和试剂: 流式细胞仪 FACScan, 美国 Becton- D ickinson公司产品; 一次性 12mm ? 75mm Falcon试管, 购自 BD公司; 酶标仪 (Denley D ragonMK 2 . 3V ersion8. 0); 单克隆 抗体: CD61(抗 GP? a抗体
8、 )、FI TC - 抗人 IgG、 FITC- 抗人 IgA和 FI TC- 抗人 Ig M 均购自晶美公司; 血小板相关抗体 ( PA Ig)酶联检测试剂盒购自上海捷门生物技术公司。 3?方法和步骤: ( 1) FCM ( PRP )法: 抗凝血 2m,l 混匀, 800r/min离心 20m in, 吸取血小板血浆层, 3000 3500r/m in离 心 10m in, 倾去上层血浆, 沉淀的血小板中加入 1 % 草酸胺 1m , l用移液管吹散沉淀, 然后静置 5m in , 再以 3000 3500r/ m in离心 10m in, 倒置弃尽上清, 加入 0?3% PBS/BSA,
9、 配成悬 液, Falcon管中加入血小板 悬液 50? l 、FITC - 抗人 IgG (或 FI TC- 抗人 IgA、 FITC- 抗人 IgM )再加入 CD61- FI TC。暗处 孵育 30m in+ PBS 1m l洗涤 2次, 再加入 0?5ml PBS后混匀后 上 FCM 检测。氩激光激发波长为 488nm, 使用 Cell Quesy软件 分析程序, 每份标本检测 5000 10000个细胞, 根据 CD61设 门, 以阴性对照管调整电压, 然后检测标本 PA IgG、PA IgA、 PA Ig M。 ( 2) EL ISA 法: 按照说明书, 分离血小板, 洗涤血小 板
10、, 计数, 溶解血小板, 离心沉淀, 上清 100? l加入酶标板, 然 后加入酶标抗体, 混匀后置 37? 1h, 取出酶标板, 用专用洗涤 液洗 4次, 加入底物 100?l/孔, 37? 孵育 10min , 加入终止剂 50? l/孔, 上酶标仪, 492nm比色, 计算含量。 4?统计学处理: 统计方法采用 STATA6. 0统计软件进行 分析, 以均数 ? 标准差表示, 方差齐性则采用方差分析和配对 t检验。定量法与 FCM 结果比较时, 数据先标准化。 结 ? ? 果 1?FCM检测血小板自身抗体正常参考值的确 定: 在我们的实验体系下, 20例正常人 FC M 检测血 小板表面
11、 IgG、 IgA和 Ig M 的荧光百分率分别为 2?56 ? 2?08 % 、 13?75? 5?98 %和 13?90 ? 7?28 % 。 2?两种方法检测正常献血员、I TP病人血小板抗 体结果比较: 详见表 1 。 ?79? ? ? 医学研究杂志?2008年 11月? 第 37卷? 第 11期? 论 ? ? 著 ? ? 表 1? 两种方法检测正常献血员、ITP病人血小板抗体结果比较 组? 别 ELISA ng /( 107? L ) FCM PA I gGPA IgAPA Ig MI gGIgAIg M 正常对照组 ( n= 20)71. 01 ? 15 . 3110. 55 ?
12、5 . 722. 75 ? 9 . 062 . 56 ? 2. 0813 . 75 ? 5. 9813. 90? 7 . 28 I TP组 ( n= 10)210. 96 ? 108 . 4122 . 14 ? 11 . 9631 . 35 ? 24 . 9928 . 13 ? 17 . 7425 . 07 ? 16 . 8423. 22 ? 17 . 85 P0. 00270. 010. 30. 0010. 030. 025 ? 3?两种方法检测 I TP患者血小板自身抗体的灵 敏度的比较: FCM 法和 ELISA法检测 IPT 患者血小 板自身抗体的灵敏度比较无显著性差异 (P 0?05
13、), 可能与病例数少有关, 但是检测率方面 FCM 已显示 出最高趋势 (表 2)。显示 FCM 检测 ITP患者血小板 自身抗体的灵敏度至少不逊于 ELISA方法。 表 2? 两种方法对 ITP患者血小板自身抗体检测率 ITP组 ELISAFCM PAIgGPA IgAPA Ig MIgGIgAIg M 阳性率 (% )6030301004030 阴性率 (% )40707006070 讨 ? ? 论 血小板自身抗体的检测对于 ITP的诊断和治疗 有重要意义。建立准确和简便的血小板自身抗体检 测方法十分重要。传统的血小板抗体检测方法是 ELISA法, 但是该方法有很多缺陷: 检测至少需 10
14、 7 个血小板, 对血小板极度减少的患者, 需增加采血量, 且检测结果不够满意; 不容易区分其他血液成分, 如 白细胞和一些破碎细胞表面的抗体, 误认为吸附 PAIg的血小板; 操作过程中容易破坏和激活血小板 引起表面抗原的丢失; 操作复杂, 较费时等。流式细 胞仪 ( FCM) 检测血小板抗体是一种新的临床检测手 段 2, 其优点是能对大量单个细胞进行快速、 灵敏、 多参数检测, 自动化程度高, 便于操作, 而且能够精确 地了解血小板上的抗体分布情况。FCM 这些优点显 著优于传统的 ELISA法。另外, FCM 法受血小板计 数影响小: 当血小板计数 50 ? 10 9 /L时, ELIS
15、A定量 法的数据常发生偏移, 极易产生假阳性, 而 FC M 则很 少受血小板计数的影响; 对于血小板计数为 10 ? 10 9 /L的标本, ELISA法检测结果常常不够准群, 对临 床判断有较大影响, 而 FCM法则基本不受影响 3。 以往 FCM 方法检测血小板抗体一般采用前向角 和侧向角散射设门 4, 方法存在一定缺陷, 主要是在 生理和病理情况下血小板群和红细胞群的碎片会有 交叉, 在严重 I TP 中, 红细胞碎片及淋巴细胞等非血 小板成分在测定区中相对比例更多, 影响准确测定。 本实验采用血小板特异性膜表面抗原标记 CD61来 标记血小板群, 设置血小板门, 能够特异性地区分血
16、小板。准确设置血小板门可避免杂志碎片的干扰, 并 采用机读的方法, 避免了实验杂质碎片的影响, 大大 提高了检测的准确性和对于血小板检测的特异性。 采用 FCM 方法检测血小板抗体操作简单, 但是一些 步骤仍然需要注意: 血液标本的保存条件需要注意, 保存和制备时所处环境温度以 20? 为宜, 4? 保存时 血小板破碎较多; 抗体孵育后宜尽快上 FC M 检测, 最 长不宜超过 24h , 否则影响检测结果。 根据我们的比较研究, FC M 确比 ELISA优越, 但 是 FCM相对费用仍较昂贵, 且需要 FCM 机器及配套 专用软件。随着操作简单的各新型 FCM的相继问世, 以及新的荧光材料的不断发现, FCM 的检验成本将日 益降低, 用 FCM检测血小板自身抗体将逐步成为临床 实验室的一项常规检测项目。有 FCM 检测条件单位, 开展 FC M 检测血小板抗体将给临床提供更多帮助。 参考文献 1? 张之南, 沈悌. 血液病诊断及疗效标准 M . 3版, 北京: 科学技术 出版社, 2007: 172- 176 2? 宋一芳. ITP
