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1、这就要用到定向改造生物的新技术 基因工程,又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,原理：,操作水平：,结 果：,基因重组,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，获得人 类所需要的品种。,基因工程：,思考：为什么能把一种生物的基因“嫁接”到 另一种生物上并成功表达？,1、大多数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺旋结构，即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则 。所以不同的生物DNA可以嫁接 2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一种生物
2、的基因可以在另外一种生物体内得以表达,DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） 限制性内切酶 DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） DNA连接酶 基因转移工具（“分子运输车”） 基因进入受体细胞的载体,“分子手术刀”限制性核酸内切酶（简称限制酶）,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,特 点：,存在原核生物 (主要是微生物)体内。,专一性,来 源：,作 用：,切断两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键,中轴线,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识GAATTC 序列，并在G和A之间切开。,举例：,黏性末端,黏性末端,
3、EcoRI限制酶的切割,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端 平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,寻根问底,限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自
4、身的目的。,DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,基因的针线：DNA连接酶,、基因的针线DNA连接酶,连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,15,类型,来源,功能,相同点,差别,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷 酸二酯 键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和 平末端(效率较低),阅读课本第5页“分子缝合针”DNA连接酶的相关内容，填写下表,自主学习,都能催化形成
5、磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不同点： 连接酶的作用是：将DNA片段间互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？,聚合酶：以一条DNA为模板，将一个一个核苷酸连接起来,相同点：都是通过形成磷酸二酯键连接起来,载体的作用,载体的必要条件,载体的种类,阅读课本第6页“分子运输车”运载体的相关内容，填写下表,自主学习,1）能够在宿主细
6、胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 4）必须是安全的 ，对受体细胞无害。 5）载体DNA 分子应大小适中，以便于提取和操作,1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中 2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制,细菌的质粒 病毒：噬菌体衍生物、动植物病毒等。,有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,最常用运载体质粒,实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，
7、都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,最常用的运载体质粒,分布：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。,本质：细胞染色体(或拟核)外能自主复制的小型 环状DNA分子。,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,基因的运输工具质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,作为运载体必须具备哪些条件？,1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3.具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 4.对受体
8、细胞无害。,基因工程的基本操作程序主要包括 四个基本步骤：,1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定,步骤一：目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并
9、以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,启动子,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能
10、编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,请阅读P9第一和二两段,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中
11、，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,目的基因的提取方法,直接分离基因 人工合成基因,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,：鸟枪法,鸟枪法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接 载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),1、直接分离基因,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链
12、DNA (即目的基因),反转录,合成,2.人工合成基因法,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考:为什么要构建基因文库?直接
13、从含有目的基因的生物体内提取不行吗?,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA序列自动测序仪： 2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,(二)利用PCR技术扩增目的基因, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ (做启动子)、 _.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,选修1 P60,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地
14、扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（90-96）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性25-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,(二)基因表达载体的构建, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,
15、切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）, 核心,同一种,(二)基因表达载体的构建,4.过程:,5.基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们有什么作用？,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,(三)将目的基因导入受体细胞,转化 ,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法 （1）农杆菌介绍 （2）原理及适用范围,(三)将目的基因导入受体细胞,2、
