redet同源重组技术概述

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1、Red/ET同源重组技术,2015年3月25日,内 容 一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用,遗 传 重 组,基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。, 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）, 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流, 遗传重组与重组DNA技术,异常,广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流

2、过程,一、 什么是Red/ET同源重组,1. 概念 Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中 噬菌体的重组酶Red/Red 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同源重组的DNA工程技术。 2. 原理 首先重组酶沿53方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒,3. 特点： Red同源重组技术具有同源序列短(1550bp)、重组效率高、操作简单

3、、快速的特点。 4. 应用 这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。,g b a,l phage,ET,Rac phage,Rac recE/recT 操纵子 = red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Red/Red 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用； recE = red ：53 dsDNA核酸外切酶； recT = red ：ssDNA结

4、合和退火蛋白； red： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片段的消化。,噬菌体的pL操纵子示意图,Reda(RecE),Red同源重组原理示意图,RecE/RecT和Red/Red两重组系统的差异,“线状DNA线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA环状DNA”重组，选用Red/Red重组酶系统； 根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。,质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-g

5、baA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp),RecE/RecT和Red/Red两重组系统对不同类型底物重组效率的差异,Red同源重组技术相关文献,Nature Genetics (1998),Nature Biotechnology (2000),1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Red/Red或RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（1550bp）的供体DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删除、突变等； 2. 不受靶标DNA分子大小的限制； 3. 不受内切酶切

6、位点的限制； 4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、 缺失、替换等的几率； 5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩短实验周期。,二、Red/ET同源重组技术的特点,三、 Red/ET重组的作用机制,Red/ET重组链入侵模型,1.链入侵模式,Red/ET同源重组链退火模型,2.链退火模型,四、 Red/ET重组中的功能元件,1. Red、Red和Red,Red：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5-3外切酶活性。,Red结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）,Red：与ssDNA结合形成丝

7、状体，催化与互补ssDNA之间的退火。,Red：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。,2. RecE和RecT,RecE：C端39kDa的部分才是5-3外切酶活性必需，对5端为羟基的底物也有活性。,RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。,3. RecA 个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活力，增加电转化效率。,五、 Red/ET重组操作流程,引物设计合成,线性供体dsDNA底物的制备,线性载体的制

8、备,重组反应,重组产物转化至感受态细胞,重组子筛选,重组子检测,1. 设计合成引物,设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3端突出，则引物上的同源序列不包括3端突出序列的同源序列。,引物设计方法,同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）,同源臂的长度在1550bp时，重组效率就能满足实验要求，重组效率随着同源臂长度的增加而增加。,2. 线性供体dsDNA底物

9、的制备,选用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，减少PCR反应中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用Triplemaster、HotStarTaq 等），用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物； 纯化PCR产物： （1）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； （3）去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率。 降低模板对筛选工作带来的难度； （1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。,线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切 选取合适的位点，单酶切或双

10、酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。 不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需50ng/ul，高浓度的载体有利于提高效率。,3. 线性载体的制备,4. 同源重组反应,（1）配置反应体系 将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组反应（摩尔比可计算方法见附录），10 ul体系(见下表) 注意：1.目的片段与

11、载体的摩尔比在2:1-5:1之间，摩尔比低于2:1效率会降低；2.反应时间在15-30分钟，时间太短不利于重组反应,（2）短暂离心混匀，37孵育15分钟。 （3）反应结束后，取5-10ul反应液立即进行转化，剩余反应液可在4或-20保存待用。,5.重组产物转化至感受态细胞,冰上融化一管100 l的DH5感受态细胞。,加入5-10l反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。,42水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟。,注意：所使用的感受态细胞效率1108cfu/g.,加入890l SOC液体培养基，37复苏45-60分钟。,6. 重组子筛选,复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体，根

12、据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37倒置培养12-16h后观察菌落生长情况。 使用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子：在10g/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60g/mL的卡那霉素平板上重组子的数目的6倍。,抗生素使用浓度与Red/ET重组效率的关系,常用抗生素的工作浓度,7. 重组子的检测,检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等； 一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定。为避免假阳性结果，鉴定引物选择一条为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。 高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体” 现象； “质粒多聚体”问题解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA

13、”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。,卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）,“质粒多聚体” 现象,解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。,六、 Red/ET重组技术的主要应用,1. 重组质粒的构建,2. 染色体的修饰,3. 亚克隆（Subcloning）,4. 直接克隆（Direct cloning）,1. 重组质粒的构建,(1) 传统基因克隆技术的缺点 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切 酶的消化，当缺少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，利用内

14、切酶消化难以得到相应的产物。 方法看似简单，但实验周期长。 大片段难以与载体正确连接。 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。,限制性内切酶,连接酶,步骤1： 酶切目的片段,步骤2：酶切载体,步骤3: 目的片段与载体连接,同源重组克隆步骤,传统克隆步骤,步骤4: 重组子转化到感受态细胞,同源重组克隆与传统克隆比较,插入选择标记,插入无选择标记的DNA片段,2. 染色体的修饰,E. coli染色体上插入抗性基因,传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较,（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小,3. 亚克隆 （Subcloning）,4. 直

15、接克隆 （Direct cloning）,（A）亚克隆和直接克隆示意图,Red/ET subcloning,亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇,直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇,3 mg基因组DNA用EcoR V消化,Mx unknown PKS gene cluster (36kb),p15A ori,Cm,PKS from other bacteria： Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse,异源表达,七、 Red/ET重组新技术的发展,1. 三重同源重组（Triple recombineering）,三重同源重组示意图,cry1Ac的启动子片段和终止子片段“一步”重组入pHT315质粒上,2. 四重同源重组（Quadruple recombineering）,四重同源重组示意图,质粒pR6K-GT1-cotc-lacZneo上目的片段（6123bp）插入人类scn10a基因BAC的第一个内含子中,3. “双同源臂”策略(Double homology arms strategy),“双同源臂”策略示意图,