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1、ProteinA、ProteinG与抗体的结合1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合目前，约70-80%的抗体纯化使用Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。蛋白A也可以结合另一些免疫球蛋白，如用于某些种
2、属的IgA、IgM的纯化。天然 (Native Protein A) 和重组的蛋白A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与IgG 的结合能力。蛋白A 与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决定于结合强度 (解离常数) 及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间)。2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。其通过类似于蛋白A 的非免疫机制与抗体的F
3、c段结合。像蛋白A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的IgG, 多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白G还可以和某些抗体的Fab 和F (ab)2 段结合。Protein G是从G类Streptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的IgG Fc段结合(包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG的纯化。相对于Protei
4、n A，Protein G对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力，尤其是对于IgG的亚基，如人 IgG3，小鼠IgG1和鼠 IgG2a。与Protein A不同，Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。 重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在亲和力、稳定性等方面好。本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶6B上，成为用于抗体分离纯化的亲和层析介质本产品稳定性好，基团脱落少
5、，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少。二、 亲和介质特性：特点基团脱落少，结合特异性强基质6% 的交联琼脂糖凝胶配基重组蛋白G配基密度6mg 重组蛋白G/ml吸附载量3-7mg 鼠IgG2a/ml亲和介质的颗粒大小50-160m最大流速200cm/hpH 范围3-10 ，在位清洗时pH 范围可到2-11使用温度常温保存温度+48保存液体20% 乙醇三、 适用范围Protein A和Protein G的相对结合强
6、度物种物种亚类亚类protein A 结合protein G 结合人lgA可变-lgD-lgD-lgG1+lgG2+lgG3-+lgG4+lgM可变-鸡蛋黄lgY-牛+狗+山羊-+豚鼠lgG1+lgG2+仓鼠+马+考拉-+骆驼-+猴(恒河)+小鼠lgG1+lgG2a+lgG2b+lgG3+lgM可变-猪+兔+大鼠lgG1-+lgG2a-+lgG2b-+lgG3-+绵羊+/-+ =强结合，+ =中等结合，- =弱或不结四、 缓冲液配制建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。A缓冲液1mol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14) 358.14g1500 mM NaCl l(MW6
7、8.08g/mol) 87.7g 溶于1升水，滤膜过滤B缓冲液 1mol/L NaH2P04 (MW156.01) 156.01g 1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 87.7g溶于1升水，滤膜过滤C吸附和洗涤缓冲液 根据所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合，然后再加9倍体积的水，稀释成应用溶液。如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温-20至终浓度0.05%D中和缓冲液:A液77.4ml 、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液E洗脱液 0.1mol/L NaH2P04 (MW156.01) 15.601g 150 mM NaCl l(MW68.08g
8、/mol) 8.77g溶于1升水，滤膜过滤，HCl调整PH至3.0五、应用举例 A实验名称：从小鼠腹水中分离纯化IgG2a1、 重组蛋白G 琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为1ml，流尽20%乙醇溶液；2、以缓冲液C平衡5-10个床体积，流速为1ml/min；（缓冲液C配制方法：取A液35.2ml、B液64.8ml，再加900ml水，混合后PH6.5）.3、 将0.2ml小鼠腹水用缓冲液C稀释到2ml，0.45m 滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；4、 用缓冲液C再洗5-10 个床体积，流速为1ml/min；5、 用洗脱液E,洗脱3体积。6、在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以PH试纸确认溶液为中
9、性。溶液太酸，会损伤抗体活性（中和缓冲液配制方法：A液77.4ml 、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液7、 将分离纯化的IgG2a 与对照品同时进行SDS-PAGE 电泳分析。8、 用纯水流洗10个柱床体积，再用20%的乙醇流洗10 个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+48环境中保存表三，25下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制pHA液1mol/L Na2HPO4(ml)B液1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.26
10、8.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8根据比例量取混合，然后在加9倍体积的水，稀释成应用溶液。B免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：（1）蛋白样品的准备：1）对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。3） 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。4）对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量
11、进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。（2）.去除非特异性结合(可选做)：1）. 取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4缓慢摇动30分钟至2小时。2）. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal I
12、gG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。（3）.免疫沉淀：1）. 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4缓慢摇动过夜。2）. 再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。)3）. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+GAgarose。4）. 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。5）. 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。6）. 100或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20保存。
