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1、甘草有效成分的提取分离实验方案实验目的：通过对甘草中甘草黄酮、甘草酸和甘草多糖的提取分离，进一步理解他们的理化性质，并且初步掌握提取分离的方法。实验原理：黄酮类化合物则泛指两个苯环（A 环与 B 环）通过中央三碳相互联接而成的一系列化合物。根据中央三碳的氧化程度、是否成环、B 环的联接位点等特点，可将该类化合物分为多种结构类型。代表化合物有甘草黄酮、甘草素、异甘草素、甘草甙、异甘草甙、甘草查尔酮等。甘草中已经发现的黄酮类化合物有一百多种，本实验只对其进行粗提，并且测定其总含量。甘草酸是一类三萜类皂苷，主要以甘草酸钾、钙盐的形式存在，是甘草次酸的二葡萄糖醛酸甙，含量在 4-20%之间；甘草酸水解
2、脱去糖酸链变形成了甘草次酸。超临界 CO2 萃取甘草总黄酮的萃取率是 1. 35%，含量 32. 45%，是索氏提取法提取甘草总黄酮的提取率的 2.2 倍，索氏提取溶剂用量是超临界 CO2 萃取的 6 倍。本实验采取超临界 CO2 萃取法提取甘草黄酮。 【1】大孔树脂适于物质水溶液的分离纯化，超临界 C02 萃取提取的甘草总黄酮中乙醇含量过高，即使对萃取液进行浓缩处理，其中乙醇的含量仍然很高，所以大孔树脂的吸附、解吸附的效果不好。萃取液浓缩近干加入水后，所要分离的物质析出变混浊，也不适合用大孔树脂进行分离纯化。与大孔树脂层析比较，硅胶柱层析可以更有效的分离纯化甘草黄酮。使用硅胶柱层析可以有效地
3、使甘草黄酮类物质的含量达到 55%以上，收率 1. 12%，符合国家中药二类新药的原料要求。 【1】 综合考虑，本实验选择硅胶柱层析对甘草黄酮进行分离纯化。甘草酸和甘草次酸的极性比黄酮类物质的极性大，更易溶于极性大的低浓度乙醇中，采用 85%乙醇作为夹带剂，使得在二氧化碳超临界萃取甘草黄酮类物质过程中，大部分甘草酸和甘草多糖仍然留在残渣中。鉴于甘草酸和甘草多糖都溶于水的性质，本实验采用超声或微波辅助法对它们同时进行提取 3。对于提取后的甘草酸和甘草多糖的分离，可查阅到的方法包括醇沉酸沉法 3。考虑到大孔吸附树脂对糖类的吸附能力很差，也可以尝试用大孔树脂对甘草酸和甘草多糖进行分离。本实验采用前者
4、进行分离。一、甘草黄酮的提取：超临界 C02 萃取法工艺 【1】 ：原料粒度:40-60 目投料量:180g/罐萃取压力:30Mpa萃取温度:50 0C夹带剂及液固比: 85%乙醇，液固比(V：W)为 5:1C02 流量:l0kg/h萃取时间:5 小时分离压力:5. 5Mpa.分离温度:40 0C二、甘草黄酮的分离纯化：硅胶柱层析工艺 【1】 ：萃取液浓缩干品:硅胶量=0.5:20流速：1.0 倍柱体积/小时流动相：CHCl 3 : CH30H=4 :1 三、甘草酸和甘草多糖的提取：超声辅助溶剂提取法工艺 【1】 ：溶剂：水提取次数：3 次，每次 25min温度：45 0C固液比=1: l0超
5、声功率：1000W四、甘草酸和甘草多糖的分离：醇沉酸沉法 5(1)萃余相用 95乙醇或无水乙醇调节至乙醇浓度为 5080，静置 824 小时，过滤，上清液备用，滤渣干燥得甘草多糖粗品。(2)上清液浓缩至 20时的比重为 1.051.20，用硫酸或盐酸调 pH至 1.52.0，室温或 410低温静置 848 小时，去上清液，沉淀物用冷水或冷酸水洗涤至洗涤水 pH35，沉淀物干燥得甘草酸粗品。五、含量测定：分光光度法1、甘草黄酮含量测定 1标准曲线绘制：精密称取在 105干燥恒重的芦丁对照品适量，用95%乙醇溶解，摇匀，定容使之成为浓度为 1mg/ml 的芦丁标准品溶液，作为贮备液。精密量取上述溶
6、液 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4. 0.5, 0.6m1，分别加水至 3m1，加 5%亚硝酸钠水溶液 0. 5m1，放置 6 分钟，加 10%硝酸铝 0.5m1,混匀后放置 5 分钟，加入 5%氢氧化钠溶液25m1,混匀，放置 15 分钟后，蒸馏水定容至 lOml。用 721 紫外分光光度计，在 =500nm 处测吸收度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。含量测定：测出样品吸光度，带入回归方程，计算得出样品浓度。2、甘草多糖含量测定 3标准曲线的制备：精密称取干燥恒重的葡萄糖 0.0194g,配成 1OOml溶液，浓度为 0.194mg/ml。从中精密吸取 O.lm
7、l, 0.2m1,0.3m1, O.5ml, 0.7m1, 0.9m1，分别加入 1 ml 苯酚溶液和 5ml 浓硫酸，300C 恒温 O.5h，冷水浴冷却至室温，定容到 5Oml，在 490nm 处测定吸光度。以不加样为空白。以浓度 C 对吸光度 A 回归,做回归方程。含量测定：测出样品吸光度，带入回归方程，计算得出样品浓度。3、甘草酸含量测定 3标准曲线的制备：精密称取适量甘草酸标准品，配成 0.4217mg.m1-1的标准溶液。分别精密量取 1.00m1, 2.00m1, 3.00m1,4.00m1 的标准溶液，用 50%的乙醇溶液稀释至 250m1,在最大吸收波长 max= 259nm 处测吸收度，以空白为参比液，得线性回归方程.含量测定：测出样品吸光度，带入回归方程，计算得出样品浓度。1付玉杰. 甘草黄酮和甘草酸提取纯化工艺研究D.东北林业大学 ,2002.2王巧娥. 甘草有效成分的新型提取技术及高速逆流色谱分离方法研究D. 厦门大学, 2004.3李炳奇,刘振华,马燕. 超声法联合提取甘草渣中多糖和甘草酸的研究 J. 现代食品科技,2006,04:26-28.4李春英. 甘草多糖提取纯化工艺研究D.东北林业大学,20025专利号：CN 1803789 A
