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1、1肾络瘀阻证患者肾间质中 SMA 的表达及意义作者：杨东,杜永平,沈青,陈威,于艳,陈光磊【摘要】目的：研究 平滑肌肌动蛋白（alphasmoothmuscleactin,SMA ）在肾络瘀阻证患者肾小管间质中的表达特征。方法：采用免疫组织化学法检测 54 例肾络瘀阻证患者肾穿刺标本中间质SMA 的表达。结果：肾络瘀阻的程度与肾间质纤维化程度呈正相关（P0.01） ，并与间质中 SMA 的表达呈正相关（P0.01） 。结论：肾络瘀阻是中医认识肾纤维化的病理本质之一，随着血瘀程度的加重，肾间质中肌成纤维细胞大量增殖，是导致肾间质纤维化的重要原因。【关键词】肾病纤维化 肌动蛋白成纤维细胞Concl
2、usion:Kidneycollateralstasisisoneofthemainreasonsofrenalfibrosis.Withtheincreasingofkidneycollateralstasis,MFBsintherenalinterstitiumproliferateobviously,becomingoneofthemostimportantcausesofrenalinterstitialfibrosis.Keywords:nephrosis;fibrosis;alphaactin;fibroblasts肾间质纤维化（renalinterstitialfibrosis,
3、RIF）是指由多种原因引起的细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）成分在肾间质过度沉积，它几乎是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础1 。因此，拮抗肾纤维化，延缓肾衰竭的发生、发展，一直是研究的重要方向。现代研究证实，多种因素参与肾间质纤维化的过程，其中肌成纤维细胞（myofibroblast,MFB）是引发肾间质纤维化的一个重要因素。祖国传统医学认为瘀血是肾间质纤维化的基本病机之一，贯穿疾病始终，活血化瘀法（补脾肾活血化瘀法、活血化瘀解毒法、活血化瘀养血生血法等）可用于慢性肾间质纤维化全过程的治疗。因此，我们通过检测 MFB 的标志蛋白 平滑肌肌动蛋白
4、（alphasmoothmuscleactin,SMA ）在患者肾活检标本的表达，研究肾络瘀阻证与 MFB 之间的关系以探讨肾间质纤维化的发生机制，并为活血通络治疗提供实验依据。1 资料与方法1.1 临床资料选择第四军医大学西京医院 2006 年 9 月至 2007 年 3 月肾内科做肾活检的住院患者 54 例为研究对象，其中男 26 例，女 28 例。临床诊断为免疫球蛋白 A（immunoglobulinA,IgA）肾病 16 例，IgM 肾病 3 例，狼疮性肾炎 6例，紫癜性肾炎 7 例，肾病综合征 9 例，间质性肾炎 2 例，糖尿病肾病 4 例，隐匿性肾炎 2 例，乙肝相关肾病 3 例，
5、高血压肾病 2 例。所选患者均有不同程度的肾间质纤维化，并且按照其纤维化程度分为轻度、中度和重度组。计算各组每位2患者的血瘀指数。1.2 肾间质纤维化的评价肾活检组织经中性缓冲液福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片 3m 进行 Masson 三色染色。在 MPIAS500 彩色病理分析系统下计算肾间质纤维化指数：高倍镜（200）下随机选 10 个不重叠视野，测定间质纤维化面积占同视野小管间质总面积的百分比。积分如下：无病变为 0 分；小于25为 1 分，25%50为 2 分，大于 50为 3 分。每张切片取 10 个视野平均积分，再在各组内取平均值。1.3 血瘀指数计算所有病人均参考血瘀证诊断标准
6、2 ，将肾络瘀阻证有关临床表现列为 10 项：（1）面色黧黑或晦暗；（2）腰痛固定，隐痛或刺痛；（3）肌肤甲错或肢体麻木或爪甲青紫；（4）舌色紫暗或有瘀点、瘀斑，舌下筋系瘀紫；（5）脉象细涩；（6）血纤维蛋白原含量增高；（7）B 超示肾脏内血流压力改变；（8）血液流变学检测全血黏度或血浆黏度升高；（9）鼻衄及齿衄；（10）血尿。每项 1 分，计算总积分，每位患者所得总分作为血瘀指数来判断血瘀程度，3 分诊断为肾络瘀阻证，其中以有无血尿以及血纤维蛋白原含量是否增高作为主要诊断依据。1.4 免疫组化检测小鼠抗人 SMA 单克隆抗体购于武汉博士德公司。兔抗小鼠免疫组化 SP 即用型试剂盒购于北京中山
7、公司。石蜡切片厚 3m，二甲苯脱腊，梯度酒精依次脱水，0.3H2O2 室温孵育 30min，蒸馏水冲洗，10山羊血清封闭 371h，按 1150 比例加入一抗 4过夜，37复温 1h，多聚L 赖氨酸和磷酸盐缓冲液（PBS）洗 5min3 次，加入二抗 371h，PBS 洗 5min3次，3,3 二氨基联苯胺盐酸盐（3,3diaminobenzidine,DAB ）显色510min，水冲洗，复染，脱水透明后封片，镜检。以 PBS 代替一抗作为阴性对照。每份标本分别选取 5 个低倍镜（10）视野，采用免疫组化分析软件（HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告分析系统）进行免疫组化阳性表达分析，
8、对选取视野内 SMA 免疫组化阳性信号进行图像分析，计算小管间质免疫组化检测阳性面积和小管间质总面积的比值，取 5 个比值的平均值作为每例患者肾小管间质区域 SMA 的阳性率（） 。1.5 血液检测指标患者入院时检测血液流变学、血纤维蛋白原、血肌酐、血尿素氮等指标。1.6 统计学方法应用 SPSS11.0 对数据进行统计学分析，数值以 xs 表示，采用单因素方差分析以及直线相关分析方法。2 结果2.1 血瘀指数与肾间质纤维化程度的相关关系轻度、中度和重度损伤组患者的血瘀指数分别为 3.140.56、4.870.89、6.630.86；随着肾间质纤维化的程度逐渐增加，血瘀指数显著增加（P0.05
9、） 。见表 1 和图 1。肾间质纤维化程度与血瘀指数呈正相关（r0.889，P0.05） 。32.2SMA 在肾络瘀阻患者肾间质内的表达以及相关关系轻度损伤组SMA 在病变间质中散在表达，其中包括间质细胞和部分肾小管上皮细胞；中度和重度组 SMA 的表达显著增加（P0.05） 。中到重度病变组患者的肾小球内也可见 SMA 表达，主要出现在系膜区。见表 1 和图 2。相关分析显示，血瘀指数与 SMA 在肾间质内的表达水平呈正相关（r0.68，P0.05） 。2.3 血瘀指数与肾功能的相关关系血瘀指数与血肌酐、血尿素氮呈负相关（P0.05） ，相关性 r 值分别为0.623 和0.685。表 1
10、各组患者的血瘀指数、肾间质 SMA 表达以及血肌酐和血尿素氮含量（略）Table1Indexofbloodstasis,expressionofSMAintherenaltubulointerstitiumandthecontentofserumcreatinineandbloodureanitrogenindifferentgroups*P0.05,vslightfibrosisgroup;P0.05,vsmoderatefibrosisgroup.图 1 光学显微镜下肾活检的病理学特征（Masson 染色，200） （略）Figure1Pathologycharacteristicsofr
11、enalbiopsyspecimensundermicroscope(Massonstaining,200)A:Lightfibrosis;B:Moderatefibrosis;C:Severefibrosis.图 2 光学显微镜下 SMA 在肾间质的表达（免疫组化染色，200） （略）Figure2ExpressionofSMAintherenaltubulointerstitiumundermicroscope(Immunohistochemicalstaining,200)A:Lightfibrosis;B:Moderatefibrosis;C:Severefibrosis.3 讨论正常
12、肾间质中的主要细胞类型是成纤维细胞、血管周细胞和单核巨噬细胞，并没有 MFB。MFB 兼有平滑肌细胞和成纤维细胞的特点，既具有收缩功能，又能产生胶原和 ECM 成分。作为活化的成纤维细胞，MFB 主要表达 SMA。研究表明一旦受到缺血、缺氧和炎症等刺激，平时处于静息状态的肾间质成纤维细胞就会发生功能和表型改变，转变为表达 SMA 的 MFB，而 MFB 合成 ECM 的能力显著增强1 。ECM 持续大量在肾间质中沉积，最终导致肾间质纤维化、肾脏结构破坏和功能损伤。除此以外，间质中肾小管上皮细胞和血管平滑肌细胞受到刺激4发生活化，也可以转分化为 MFB。根据发展过程中的临床表现及发病特点，肾间质
13、纤维化属中医水肿、癃闭、关格、肾劳、溺毒、尿血等病证范畴。中医学认为本病属本虚标实之证，本虚主要是肺、胃、脾、肾虚，其中尤以脾肾虚为主；标实则以湿浊、湿热、瘀血、湿毒为主。其中血瘀又常常是导致该病加重和恶化的直接原因，研究证实活血化瘀药物具有减轻肾间质纤维化的作用，在一定程度上改善肾功能35 ，从辨证求因的角度反证了这种肾络瘀阻证的存在。我们在实验中发现，肾络瘀阻证患者血瘀指数随着间质纤维化程度增加而加重，并且与间质中 SMA 的表达量呈正相关（P0.05） ，这说明血瘀作为致病原因之一，参与了肾间质纤维化的发生、发展过程，并与表达 SMA 的 MFB 密切相关。我们还发现肾络瘀阻患者血瘀程度
14、与肾功能指标血肌酐、血尿素氮的水平呈负相关（P0.05） ，随着血瘀程度的加深，患者肾脏功能逐渐下降，甚至衰竭。中医认为慢性肾病病程日久，脏器虚损，气化障碍，则导致气滞血瘀、气虚血瘀。 “气结则血凝” 、 “气结则血滞” ，随着纤维化程度的加重，慢性肾病患者多有血瘀证的表现，且随着病程日久，病情加重，血瘀证亦加重。以往研究发现，活血化瘀药能够抑制成纤维细胞增殖，并抑制肾小管上皮细胞转分化，而我们的实验也在验证了肾络瘀阻证与成纤维细胞和肾小管上皮细胞活化、转分化呈正相关的基础上，为使用活血化瘀治则治疗、抑制肾间质纤维化，抑制 MFB 的增殖提供了实验基础和理论依据。【参考文献】1LiC.Orga
15、nfibrosis:foundationandclinic.Beijing:PeoplesMedicalPublishingHouse.2003:113114.Chinese.李才.器官纤维化:基础与临床.北京:人民卫生出版社.2003:113114.2ChinaSocietyofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine.Diagnosticcriteriaforsyndromeofbloodstasis.ZhongXiYiJieHeZaZhi.1987;7(3):129.Chinese.中国中西医结合研究会.血瘀证诊断标准.中西医结合杂志.
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