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1、1细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析作者：胡耀华,钟文彬,周林,黄树林【摘要】目的建立高效毛细管电泳法测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的分析方法，测定细菌代谢产物中的小分子有机酸。方法采用毛细管：Beckmancoulter 未涂层 50m60cm(有效长度 50cm);缓冲溶液：pH10.5 的10mmol/L(含 0.5mmol/LCTAB)的硼砂溶液;检测波长 214nm，分离电压-20kV，进样压力为 1.0psi，进样时间为 10s。结果 4min 内甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸得到基线分离。线性范围分别为：甲酸 3.830.7mg/L(r=0.9971);乙酸3.352
2、.5mg/L(r=0.9961);丙酸 3.149.5mg/L(r=0.9993);丁酸348mg/L(r=0.9925);乳酸 7.560.5mg/L(r=0.9995)。平均回收率分别为:甲酸 99.29%(RSD=0.67%);乙酸 98.90%(RSD=1.36%);丙酸 99.65%(RSD=0.65%);丁酸99.35%(RSD=0.42%);乳酸 98.06%(RSD=1.44%)。结论该方法简单、快速、准确，可用于细菌发酵液中代谢产物有机酸的检测。【关键词】细菌代谢产物小分子有机酸高效毛细管电泳Abstract:ObjectiveToestablishamethodfordet
3、erminingformicacid,aceticacid,propionicacid,butyricacidandlacticacidinbacterialmetabolitesbythehighperformancecapillaryelectrophoresis.MethodsSampleswereanalyzedonaBeckmanCoulter(50m50cm)uncoatedfusedsilicacapillaryusing10mmol/Lboratebuffer(pH10.5,containing0.5mmol/LCTAB).TheUVdetectionwavelengthwas
4、214nm,theseparationvoltage-20kVandinjectionpressure1.0psi10s.ResultsStandardsamplesofformicacid,aceticacid,propionicacid,butyricacidandlacticacidwereseparatedwellin4minutes,andtheirlinearrangeswere3.8-30.7mg/L(r=0.9971),3.3-52.5mg/L(r=0.9961),3.1-49.5mg/L(r=0.9993),3.0-48.0mg/L(r=0.9925),7.5-60.5mg/
5、L(r=0.9995),respectively,theiraveragerecoverieswere99.29%,98.90%,99.65%,99.35%and98.06%,respectively.TheRSDvalues(n=6)offormicacid,aceticacid,propionicacid,butyricacidandlacticacidwere0.67%,1.36%,0.65%,0.42%,1.44%,respectively.ConclusionThemethodissimple,rapidandaccuratefordetectingtheorganicacidsin
6、bacterialmetabolitesinfermentationliquor.Keywords:metabolicproduct;organicacid;highperformancecapillaryelectrophoresis代谢流量是细胞生理学的一个基本决定因素，也是代谢途径中最重要的参数。对细菌进行代谢流量分析，特别是代谢产物中小分子有机酸的分析，有助于通过基因工程手段定向地、有目的地改变限制细胞代谢的关键途径，以更好地理解和利用细胞代谢进行化学转化、能量转导和活性产物表达1。在发酵过程中，产酸发酵细菌能将有机物转化为以脂肪酸和醇为主的末端产物，同时生成新的细胞物质。产酸发酵速率
7、较快，末端产物主要有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己2酸、乳酸等脂肪酸以及醇类(乙醇等)、二氧化碳、氢气、氨、氮气等2。通过分析这些发酵末端产物可以了解细菌的代谢途径，而代谢通量的分析可以使所需要的一些关键操作单元协调运行，从而达到副产物最小而产率最优的目的3。毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有效率高、分离检测样本的速度快、所需要的样本和试剂少、检测的模式多且可以和其他技术联用、试剂易得廉价、能够实现自动化的优点，越来越广泛地被用于有机酸的分析4。影响有机酸分离的主要因素有：缓冲溶液的种类、缓冲溶液的 pH 值、电渗流改性剂和添加剂、
8、分离电压等。本研究建立了 CE 法(区带电泳分离模式)测定小分子有机酸的方法，并对缓冲溶液的种类、pH 值以及添加剂等对电泳分离条件进行了研究，从而为研究细菌的代谢途径提供技术手段。1 材料与方法1.1 仪器和试剂高效毛细管电泳仪：BeckmanCoulterP/ACEMDQ 毛细管电泳系统(32KaratTMSoftwarever5.0)，毛细管为 BeckmanCoulter 未涂层50m60cm(有效长度 50cm)。甲酸、乙酸(Sigma 公司，色谱纯)，丙酸、丁酸、乳酸(Sigma 公司，分析纯)，四硼酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(广州市化学试剂厂，分析纯)。所有溶液均用超
9、纯水配制和稀释，标准样品和缓冲液经0.22m 滤膜过滤后进样。1.2 方法1.2.1 毛细管电泳环境的平衡每次进样前毛细管先用水洗 3min，再用0.1mol/L 的 NaOH 溶液冲洗 3min，水洗 3min，然后再用缓冲液冲洗 5min。每次更换试样时均用缓冲液清洗 510min，所需时间以基线平稳为准。1.2.2 检测波长的选择以 190250nm 为检测波长，检测各种有机酸和运行缓冲液的紫外吸收特性，选择各有机酸吸光度相对较大、而缓冲液吸光度相对较小的波长为检测波长。1.2.3 缓冲液浓度的选择采用 214nm 检测波长，分离电压-20kV，进样压力为 1.0psi，进样时间为 10
10、s，在 pH 值为 10.5 的情况下，评价 1025mmol/L 的硼砂缓冲体系。1.2.4 缓冲液 pH 的选择分别以 pH9.0、pH9.5、pH10.0、pH10.5、pH11.0 的缓冲溶液进行分离，各有机酸分别进样，以缓冲液 pH 值对各有机酸的保留时间作图。1.2.5 分离电压的选择分别以 10、15、20、25kV 为分离电压进行分离，各有机酸分别进样，以分离电压对各有机酸的保留时间作图。31.2.6 分离温度的选择分别以 15、20、25、30、35为分离温度进行分离，各有机酸分别进样，以分离柱温对各有机酸的保留时间作图。1.2.7 各种有机酸标准样品的定性和定量将各种单一有
11、机酸液依次进样,记录各自保留时间。以上述优化结果为实验条件，5 种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(每个样品平均进样 3 次)，以有机酸浓度对峰面积作图,建立标准曲线。1.2.8 有机酸混合样品的分析配制不同浓度的有机酸标准混合液进行定量分析，积分计算峰面积，比较计算值与实际值的误差，得出样品回收率和检测精确度，论证分析方法的准确性和重复性5。2 结果2.1 发酵液中小分子有机酸的紫外吸收特性大多数有机酸在 200nm 以上无吸收或吸收很小，用间接紫外检测时其背景电解质吸收要求尽可能低。缓冲溶液中硼砂的紫外吸收较低，因此试验了硼砂溶液的紫外吸收特性。图 1、图 2 分别
12、为各种有机酸标准样品和背景电解质硼砂的紫外吸收光谱。结果表明：当波长小于 220nm 时，大多数有机酸都有紫外吸收;当波长小于 210nm 时，背景电解质的紫外吸收增加很快，影响有机酸的测定。综合考虑，选择 214nm 作为检测波长，在该检测波长处常见有机酸都有比较理想的吸收值。2.2 电渗流改性剂对分离的影响有机酸阴离子的电泳方向与电渗方向相反，通常加入阳离子表面活性剂使电渗反向，从而与有机酸阴离子的电泳方向一致，以缩短分析时间。因此本实验在缓冲液中加入 0.5mmol/L 的 CTAB 作为电渗流改性剂。实验发现，在未加 CTAB 之前，5 种有机酸在 20min 内才能得到分离，加入 C
13、TAB 后时间缩短到 5min。2.3 最佳反应体系的建立2.3.1 缓冲液浓度的选择在大多数情况下，随着缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速度降低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，迁移时间延长。而且随着缓冲液浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场强度下毛细管的电流值增大，焦耳热增加。实验考察了不同浓度的硼砂对分析物的影响，分离结果见图 3。结果表明，当硼砂浓度从 10mmol/L 增加到 20mmol/L 时，保留时间呈上升趋势;当浓度大于 20mmol/L 时，保留时间有所下降;在 20mmol/L 时，保留时间最长。为保证体系的稳定性，节约分离时间，提高检测灵敏度，选择 10mmo
14、l/L为硼砂缓冲液的最佳浓度。2.3.2 缓冲液 pH 值的选择缓冲溶液 pH 值的调节与控制是优化分离的重要因素。有机酸为弱酸，其 pKa 值大多在 26 之间。分析物的电离度依赖于电解质溶液 pH 值的变化，电离度的不同引起电泳淌度和电渗流淌度的差异，进而影响4分离效率和电泳迁移行为。由于在酸性介质中有机酸易被毛细管壁吸附，因而通常在碱性环境下实现分离。本研究选择 pH9.011.0 进行实验，分离结果见图4。从图可见，当 pH 为 10.5 时，5 种有机酸均可完全分离;随着 pH 的增大，分离度进一步得到改善，但同时使分离时间延长。综合考虑分离度、分离时间和灵敏度，选定硼砂缓冲液的最佳
15、 pH 为 10.5。2.3.3 分离电压的选择电压是控制柱效、分离度和分析时间的重要因素。分离电压的变化会引起电场强度的改变，进而影响组分的分离。本研究分别考察了电压在 1025kV 范围内的分离效果，结果见图 5。结果表明，随着电压的增大，柱效提高，因而有机酸的分析时间缩短。但过高的电压会产生较大的焦耳热，导致区带展宽，峰面积下降，从而影响分离效率和分离度。综合比较不同电压下的分离图谱，发现在 20kV 条件下各种有机酸均得到良好的分离而且保留时间适合，峰形也最好。2.3.4 分离柱温的选择柱温对电解质溶液的黏度、谱带扩展、离子淌度等有直接的影响。柱温试验发现：1535区间的不同柱温下分离
16、时间变化不大,但对各种有机酸的分离度有较大影响。在柱温为 30时，各种有机酸的分离都能较好满足工作需要，因此选择 30作为实验柱温。2.3.5 最佳反应体系综合以上各个优化条件，最终选用的毛细管分析体系为：214nm 为检测波长，10mmol/L(含 0.5mmol/LCTAB)的硼砂作为缓冲溶液，pH 值为10.5，分离电压为-20kV，进样压力为 1.0psi，进样时间为 10s。2.4 各种有机酸标准样品的定性与定量将各种单一有机酸液依次进样，记录各自的保留时间：甲酸为 2.68min，乙酸为 3.02min，丙酸为 3.13min，丁酸为 3.25min，乳酸为 3.47min。以上述优化结果为实验条件，5 种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(同一批次每个样品平均进样 3 次取平均值，系列实验重复 6 次)，以有机酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，建立标准曲线，计算相关系数并建立回归方程，见表 1。从表 1 中的线性回归方程可知，在实验样品的浓度范围
