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1、1红曲菌株的 RAPD 多态性分析作者：丁红梅葛尔宁王泽时【摘要】 目的研究红曲分离株的遗传多样性和亲缘关系，为种质鉴定、保护和利用提供参考。 方法用随机引物对 10 个红曲菌株进行 RAPD 分析，从中筛选出 63 特征性好，多态性高的 RAPD 图谱，用 NTSYSPC2.1 软件进行同一性和差异性分析并根据遗传距离构建系统进化树。 结果红曲分离株间的同一性平均 73.32%，表明它们的遗传背景具有很大的相似性；RAPD 聚类结果与菌株的形态差异相关，表明 RAPD 分子标记进行菌株鉴别与传统形态分类鉴别结果基本一致，鉴别能力较强。 结论基于 RAPD 多态性的遗传分析能从分子水平上揭示红
2、曲菌的遗传背景差异，为分类鉴定、种质起源和系统进化提供辅助手段和技术依据。【关键词】红曲菌；RAPD 分析；遗传同一性；系统进化树Abstract:ObjectiveTostudythegeneticdiversityandrelativerelationshipofdifferentMonascustrainstoprovidereferenceforclassificationandprotectionofgermplasmresources.MethodsComparingtheresultsoftherandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)fingerpr
3、intsderivedfrom10cultivatedstrainsofMonascus,63RAPDelectrophoresisatlaseswereselectedtocalculatethegeneticidentityanddivergenceamongthembyNTSYSPC2.1software.AndthenphylogenetictreeofMonascusstrainswasconceivedaccordingtotheirgeneticdistancebyclusteringmethod.ResultsItwassuggestedthatthecomparability
4、ofgeneticbackgroundswasplentybecauseof73.32%averageidentityofMonascusstrains.TheresultsofRAPDanalysiswereconsistentwiththatofmorphologicstudy,sotheRAPDmolecularmarkertechnologyisaneffectivewaytoidentifyMonascusstrains.ConclusionRAPDanalysiscanrevealthedifferentiaofgeneticbackgroundsofMonascusstrains
5、,anditcouldbeappliedwidelyinclassificationandidentification,germplasmoriginandevolution.Keywords:Monascus;RAPDanalysis;geneticidentity;phylogenetictree红曲是一味在本草纲目 、 医林纂要等都有记载的天然佳品。长期以来，对红曲菌分类鉴定均根据其形态特征和生理学特性14 。由于红曲菌属下分类的形态、生化指标均受培养基质、温度等环境条件影响，表现出较大差异性，加上有些种界限不明确，使红曲菌的命名和分类在学术上颇多争议5 。DNA 分子在物种鉴别分类和筛
6、选上比形态学、血清学、化学指纹图谱等更准2确，目前已有限制性酶酶切片段长度多态性(RFLP)，随机扩增多态 DNA(RAPD)，串联重复序列(SSR)等6直接在 DNA 水平上进行遗传分析的实验方法。由于红曲菌的分子生物学研究起步较晚，基因组序列相关信息尚不清楚，限制了常规分子生物学方法的使用。RAPD 标记技术不需要预先知道 DNA 序列信息，对 DNA 质与量要求不高，引物无种属界限7等优点使其成为研究红曲菌株鉴别、遗传分析的首选。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 供试菌株及培养基：供试红曲菌株编号 110 依次为AS3.554、AS3.972、B、F、J、M2 、P、S、ZW5
7、、古田，其中 F 为Monascusruber，余为 Monascusanka.。B、F、J、P、S 由浙江中医药大学肿瘤研究室保存，AS3.554、AS3.972、M2 、ZW5 、古田购自浙江省微生物研究所，AS3.554、AS3.972 为中国普通微生物菌种保藏中心保存菌株。MEA（maltextractagar） 6培养基。1.1.2 主要试剂及随机引物：主要分子生物学试剂购自杭州博日科技有限公司及宝生物工程（大连）有限公司，RAPD 分析所用 1O 碱基随机引物S251S350 、S2001S2050 购自上海生工生物技术公司，编号及核苷酸序列见上海生工生物技术公司网页。1.2 实验
8、方法1.2.1 红曲基因组 DNA 的提取：红曲菌体基因组 DNA 的提取采用 CTAB 法8进行。1.2.2RAPD 反应体系：RAPD 反应体系为 1PCRBufer，dNTPs1mmolL，Taq酶 1.2U，随机引物 0.2molL，模板 DNA20ng，反应总体积为 20L。1.2.3RAPD 反应参数：扩增反应在梯度 PCR 扩增仪上进行，94预变性6min，进入 92变性 40s、36退火 40s、72延伸 2min 的 35 个循环，最后72补平 7min，4终止反应。1.2.4RAPD 多态性分析：根据片段大小排列并记录,条带有计为“1”;条带无计为“0” ，构建原始数据 0
9、1 矩阵，用NTSYSPC2.1 软件计算出同一性和差异性，并用 clustering 中的 UPGMA 聚类方法构建系统进化树；用 Editfile 生成遗传同一性和差异性表。2 结果2.1 红曲菌的 RAPD 电泳图谱：用 150 条随机引物扩增 10 株红曲菌基因组DNA，筛选出条带多，特征性好，多态性高的 63 个电泳图谱作为 RAPD 分析依据。不同红曲分离株 RAPD 扩增产物有 39 条带，多集中在 3001500bp，其中主条带 24 条，次带丰富，各菌株间既有相同条带又有差异条带，如图 1。32.2RAPD 多态性分析：从选出的 63 个 RAPD 图谱发现,10 株红曲菌指
10、纹图谱条带基本一致,说明其遗传背景有很大相似性，但个别谱带之间存在不同程度差异，说明不同红曲分离株间又有丰富的遗传多样性。统计记录电泳结果，获得344 条电泳条带的 01 矩阵。用 NTSYSPC2.1 计算 10 株红曲分离株遗传同一性和遗传差异性见表 1，红曲分离株间同一性为 36.0586.05%,平均73.32%。聚类分析结果见图 2，其中 AS3.544 与 B、S 与 ZW-5 的亲缘关系较近，尤其是 AS3.972 与古田同一性高达 86.05%，遗传距离非常接近，它们可能有共同祖先。F 处于相对独立的一支，与其它红曲菌亲缘关系均较远。图 1 引物 S2042 在 10 个红曲菌
11、株中的 RAPD 扩增结果（略）M：Marker；1：AS；3.554；2：AS3.972；3：B；4：F；5：J；6：M-2；7：P；8：S；9：ZW-5；10：古田图 2 红曲分离株的系统聚类进化树（略）表 1 红曲分离株的同源性（左下）和差异性（右上） （略）3 讨论本研究显示虽然 10 株红曲菌来源各异，但同一性平均高达 73.32%，说明其遗传背景有很大相似性，这与邢旺兴等9的结果一致。结合形态学特征发现RAPD 遗传分析结果与菌株间的形态差异相关，如：RAPD 多态性提示 F 与其它红曲菌同一性仅有 40%左右，多态性较高，很可能与种间差异有关，菌落形态和显微镜检表明 F 属 M.
12、ruber 种而 AS3.554、B 等则属 M.anka 种。这表明 RAPD 指纹图谱能较好地反映红曲菌株间的遗传关系，鉴别能力较强。均分离自福建的AS3.972 和古田有地理距离优先聚类倾向,同一性高达 86.05%，遗传距离非常近，表明地缘关系也是系统分类、遗传进化重要影响因子。本研究利用分子生物学和数值分类方法研究红曲菌种质资源，从分子水平揭示红曲菌遗传背景差异，其结果与传统分类结果基本一致，表明 RAPD 分析具有较强菌株鉴别能力，不仅可作为一种辅助鉴别工具提高鉴定的准确性和客观性，而且为进一步研究红曲种质起源和进化提供参考。【参考文献】1XingWangxing,ChengRon
13、gzhen,MiHeming,etal.StudyonthephysiologicalcharacteristicsofsevenordinaryMonascusJ.TheJournalofPharmaceuticalPractice,2001，19（4）:231233.2邢旺兴.中药红曲基原真菌的高效毛细管电泳色谱法鉴别J.第二军4医大学学报，2000，21（1）：5961.3邢旺兴，陈士景，宓鹤鸣，等.中药红曲的薄层色谱法鉴别J.药学实践杂志，2000，18（2）:9395.4邢旺兴，宓鹤鸣，陈斌，等.气相色谱-模糊聚类分析法用于红曲基原菌的鉴别J.中国中药杂志，2000，25（6）：32
14、9334.5李钟庆，郭芳.红曲菌的形态与分类学M.北京：中国轻工业出版社，2003.6吴学谦，李海波，魏海龙，等.DNA 分子标记技术在食用菌研究中的应用及进展J.浙江林业科技,2004，24（2）：7580.7WeilliamsJGK，KubelikAR.DNApolymorphismamplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmarkersJ.NucleicAcidsRes,1990，18(22)：6531.8杨华，李联泰.食用菌 DNA 提取方法研究J.中国食用菌，2002，22（1）：1922.9邢旺兴，宓鹤鸣，陈士景，等.不同产地红曲基原菌的 RAPD 分析J.药学实践杂志，2001，19（3）：163165.
