动物细胞工程上课

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1、事实： 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，想一想如何来治疗该病人？,取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植,动物细胞培养,第三节 动物细胞工程及应用,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,细胞核移植,动物细胞工程技术,动物细胞工程的基础,1、概念,是指从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,2、原理,细胞增殖,一、动物细胞培养,剪碎组织,细胞培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液

2、,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,细胞贴壁生长 培养贴附性细胞时,细胞要能贴 附于底物上才能生长繁殖.,细胞接触抑制,细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,有关概念,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。,传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,有关概念,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部

3、分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？ 较植物组培培养基有何独特之处？,2、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终 培养成新个体？,主要成分 ： 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素 和动物血清等 独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多， 不能发育成新的

4、动物个体,思考题：,3、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织 做动物细胞培养材料？,4、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。,成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，分散做成细胞悬浮液有利于培养。,5、培养瓶中的细胞会充满整个培养瓶吗？,不会，细胞会贴壁分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,7、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞 间的物质是什么成份？,催化蛋白质水解。 细胞间的物质主要是蛋白质(胶原蛋白等),8、细胞膜的主要成份是什么？,蛋白质和磷脂,6、把细胞继续转移到其他培养瓶继续培养， 怎

5、样操作？,将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。,10、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物 组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,11、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,注意时间的控制,不能，因为两者的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近,9、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？,能,1）无菌、无毒的环境,保证细胞顺利的生长增殖,添加一定量的抗生素，定期更换培养液,添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清等。,4、动物细胞培养的条件,2）营养,3）适宜的温度和PH,培养室中控制,使之达到 36.5 7.27.4,

6、O2（95%空气）维持细胞的有氧呼吸 5% CO2 维持培养液的PH,4）气体环境,植物组织培养和动物细胞培养的比较,全能性,增殖,蔗糖,动物血清,细胞株、细胞系,细胞, 某些蛋白质,5、动物细胞培养技术的应用,（1） 培养健康皮肤细胞用于烧伤病人皮肤移植,（2）基因工程的受体细胞，生产蛋白生物制品： 病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体等。,（4）用于检测有毒物质,（3）细胞的生理、药理、病理研究,前景展望,资料一：,培养的动物细胞可以用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养

7、已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手段。,资料二：,人工关节软骨再生,1.第一次手术: 从病人关节软骨中未 受力的部分，取出一片约为葡萄干大小的健康软骨组织。 2.分离软骨细胞并经三星期的体外 培养，使细胞数增加约1020倍。 3.第二次手术: 清理软骨受损的部分，从下方骨头部位取出一片约与伤口大小相同的骨膜，缝在伤口上方，再将软骨细胞注射到骨膜下方。,资料三：,结果: 经过复健一年后即可恢复正常的生活。,二、动物细胞核移植,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.,克隆动物：用核移植的方法得到

8、的动物。,1、概念：,克隆羊培育过程,另一头绵羊的子宫,无性生殖,2、体细胞核移植技术的应用前景,1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程,2、保护濒危物种,3、生产医用蛋白质及组织器官的移植的供体,3、体细胞核移植技术存在的问题,1、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚。 2、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、 易出 现早衰等问题。 3、生产克隆动物费用昂贵。,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,三、动物细胞融合,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法 化学法,三、动物细胞融合,仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,细胞融合与融合诱导细

9、胞融合物质,诱导剂：病毒、聚乙二醇 诱导细胞融合的病毒必须灭活。 思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？,四、单克隆抗体,什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 效应B细胞产生抗体,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。 动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体， 每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。 每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点：特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体

10、？,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,思考：,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,3、与常规抗体相比，单克隆抗体有什么优点？,产量高，特异性强

11、，灵敏度高,4、整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种）， 第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个 杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。 由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。 这里的单克隆的确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,B BB B瘤 瘤瘤 瘤,5、细胞融合后培养液中有几种细胞？,6、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤

12、细胞 B淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞 A B C D,C,单克隆抗体的应用,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹” 治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,效应B细胞,抗体,细胞融合和筛选,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,制备单克隆抗体,不能，小鼠未免疫无法获得产生 单一抗体的效应B细胞,6、过程指细胞培养，目的是_ _，该过程包括 _培养和_培养两个阶段。,原代,传代,5、此方案经过2次筛选，其目的不同， 是通过筛选获得_ 是通过筛选获得_,7、图中的培养能获得_ 细胞，便于大规模培养，抗体最终可 以从_和_中获得。,杂交瘤细胞,产生特定抗体的杂交瘤细胞,在体外,条件下大量增殖,足够量的杂交瘤,细胞培养液,小鼠腹水,