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1、1泡桐花总黄酮抗哮喘豚鼠气道炎症的作用机制探讨作者：陈保红， 李寅超， 赵宜红， 傅蔓华 【关键词】 豚鼠；,慢性气道变应性炎症；,泡桐花总黄酮摘要：目的通过豚鼠哮喘模型研究泡桐花总黄酮抗哮喘气道变应性炎症的作用。 方法以卵蛋白（OA）致敏豚鼠为动物模型，灌胃途径予以泡桐花总黄酮大、小剂量，观察各组豚鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、嗜酸性粒细胞（EOS）数和嗜酸性粒细胞特异性趋化因子（Eotaxin）的改变。结果泡桐花总黄酮可显著延长致敏豚鼠的引喘潜伏期，不同程度地抑制 BALF 中的 EOS 和白细胞总数及气道上皮 Eotaxin 的过度表达。 结论泡桐花总黄酮对哮喘具有一定的保
2、护作用，其中泡桐花总黄酮可能通过调控 Eotaxin 在气道黏膜上皮的过度表达，进而抑制 Eos 向哮喘气道的募集，消除气道炎症，成为其发挥抗过敏性哮喘的重要环节。关键词：豚鼠； 慢性气道变应性炎症； 泡桐花总黄酮Abstract：ObjectiveThis study was designed to investigate the effects of flavonoids in Fructus Paulowniae on IAR and LAR.MethodsAn guinea pig asthmatic model, induced by OVA was administered by
3、intragastric gavage(ig) with different doses of flavonoids in Fructus Paulowniae. The latent period, the number of acidophils and the Eotaxin in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were observed. ResultsThe flavonoids in Fructus Paulowniae could delay the latent period of airway inflammation signific
4、antly. The number of acidophils and total white blood cell in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was restrained by flavonoids in Fructus Paulowniae. In addition, the flavonoids in Fructus Paulowniae could inhibit the overexpression of Eotaxin in the trachea epithelium.ConclusionThe results suggest t
5、hat flavonoids in Fructus Paulowniae can antagonize airway inflammation by inhibiting the overexpression of the Eotaxin in trachea epithelium.Key words：Paulounia fortunei(Semsl.)Hemsl; Flavonoids; Bronchia asthma 气道炎症是支气管哮喘(asthma)的病理基础，有多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与其炎症过程1 。研究发现2嗜酸性粒细胞（EOS）趋化聚集，在气道炎症的形成过程中起重要作
6、用，Eotaxin 是 EOS 的选择性趋化剂3 ，也是 EOS 在哮喘发病过程中选择性增加的原因。因此，调控 Eotaxin 的过度表达，抑制 EOS 在气道内的募集，消除气道炎症，对治疗哮喘具有关键性意义。根据文献报道4，5 ，少常用草药泡桐花在支气管哮喘的临床治疗上具有一定的效果；泡桐花浸膏能够明显改善哮喘豚鼠肺组织的病理损伤，对哮喘豚鼠有显著的治疗2作用；泡桐花主要成分6为挥发油、总黄酮、熊果酸等，其中总黄酮含量较丰富（3.081%） 。我们以泡桐花总黄酮为研究对象，采用 ig 给药途径，结合图象分析技术探讨其抗哮喘作用及其机制。1 材料与方法 1.1 动物与分组健康白化豚鼠，雌雄各半
7、，体重（20050）g，由河南省实验动物中心提供。随机分为模型、阳性、空白对照组和泡桐花总黄酮大、小剂量组。10 只/组。1.2 药品与试剂卵白蛋白（ovalbumin，OA）：Sigma 公司，Grade；Eotaxin 一抗(BA1469，Rabbit anti-Eotaxin)武汉博士德生物工程有限公司，相应二抗试剂盒及阳性对照片购自北京中山生物技术有限公司；醋酸地塞米松片，浙江仙琚制药股份有限公司，批号 051247。泡桐花总黄酮由郑州大学药学院生药学研究室提供。1.3 动物诱喘及用药参照宫兆华7方法，常规饲养观察 3 d 无异常后，予 10OA 生理盐水(N.S)溶液 200 mg/
8、kg ip 致敏，并于当天开始按表 1 剂量给药。第 15 天时，予 5%OA 的 N.S 溶液雾化吸入诱导哮喘发作。用哮喘发作（动物取出后的表现为咳嗽、呼吸困难、烦躁、抽搐、跌倒甚至死亡)的动物进行实验。1.4 用药过程中哮喘防治作用观察用药第 5，12 天及第 15 天，3 次对豚鼠进行激发实验。予 5%OA 的 N.S 溶液雾化吸入激发 10 s，封闭时间共 20 s，观察记录各组动物哮喘严重程度，取第 15 天的引喘潜伏期（自雾化开始至豚鼠腹肌痉挛、腹部凹陷出现的时间作为引喘潜伏期，超过 6 min 者以 360 s 计算）为统计指标。在第 5，12 天的激发过程中，先后有 8 只动物
9、（大、小剂量组各 2 只，模型组 3 只，阳性组 1 只）因反应剧烈，抢救不及而窒息死亡。1.5 BALF（broncho alveolar lavag fluid BALF）的采集与细胞计数暴露豚鼠气管肺，用丝线结扎右肺门处，行气管插管灌洗左肺。灌入 N.S 5 ml（抽吸 2 次）2 次，灌洗回收率大于 80%，无菌离心（1 500 r/min10 min） ，沉淀细胞以 Hanks 液处理后即刻在显微镜下计数细胞总数，细胞浓度调至2106/ml，涂片，瑞氏染色，计数白细胞总数和 EOS 数。1.6 免疫组化 Eotaxin 检测摘取右肺中叶，放入乙醇、醋酸和甲醛混合固定液中固定 48 h
10、。石蜡切片（4 m3 张）脱蜡至水，行免疫组化 Eotaxin（EOS趋化性细胞因子）染色。免疫组化操作按说明书进行，DAB 显色。另设不加一抗的切片作阴性对照。每只动物在细支气管黏膜各随机选择 5 个 Hot 视野，计算机图像分析系统检测每个 Hot 视野 Eotaxin 表达阳性信号的积分光密度 IOD，以平均值表示该动物气道 Eotaxin 阳性表达水平。1.7 统计学处理所有数据以 s 表示，使用 SPSS11.0 统计软件进行分析。2 结果32.1 泡桐花总黄酮对豚鼠引喘潜伏期的影响结果表明，各组造模动物的引喘潜伏期均较正常组缩短，表明造模动物皆发生了哮喘反应；各用药组与模型对照组比
11、较具有显著性意义，P0.05 或 0.01，说明各用药组对哮喘具有不同程度的保护作用。结果见表 1。表 1 泡桐花总黄酮对豚鼠引喘潜伏期的影响（略）与模型对照组比较，*P0.05， *P0.012.2 对 BALF 中白细胞总数与 EOS 计数的影响结果表明，泡桐花总黄酮大剂量和阳性药对 BALF 中白细胞总数和 EOS 计数有抑制作用，与模型组比较，差异有极显著性意义（P0.01） 。结果见表 2。表 2 对 BALF 中白细胞总数与 EOS 计数的影响（略）与模型对照组比较，*P0.05，*P0.012.3 豚鼠气道上皮表达 Eotaxin 阳性蛋白信号的图象分析镜下 Eotmin 阳性信
12、号主要位于支气管黏膜上皮、肺泡上皮和平滑肌细胞、肺微血管内皮细胞胞浆，内含棕黄色颗粒物质。图象分析结果显示，模型组支气管黏膜上皮 Eotaxin 表达阳性信号的 IOD 显著高于空白组，差异有显著性意义（P 均0.01） ；与模型组比较，阳性药和总黄酮大剂量组表达 Eotmin 阳性蛋白信号细胞的 IOD 明显降低，差异有显著性意义（P0.05） 。结果见表 3。表 3 对豚鼠气道 Eotaxin 阳性细胞数量的影响 （略）与模型对照组比较，*P0.05,*P0.013 讨论哮喘(asthma)是一种由多种因素引起的以可逆性气道阻塞、气道高反应和气道炎症为特征的免疫变态反应性疾病1，2 。慢性
13、气道炎症是哮喘发病的一个重要因素，有多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与其炎症过程。气道炎症是气道高反应(Bronchial Hyperresponsiveness，BHR)的基础，无论过敏性还是非过敏性哮喘，气道炎症都以 Eos 的浸润募集和激活为最终途径，而哮喘时异常高表达于气道上皮的 Eotaxin 作为 EOS 高度选择性的化学趋化剂，成为 EOS 在哮喘发病过程中选择性增加的原因2 。研究发现，浸润于哮喘模型动物细支气管黏膜的 EOS 数与该部位 Eotaxin 阳性表达水平呈显著正相关8 。因此，调控Eotaxin 的过度表达，抑制 Eos 在气道内的募集，消除气道炎症，对治疗哮喘
14、具有关键性意义。在哮喘的治疗药物中，甾体类抗炎药糖皮质激素等是目前较有效的药物，但因其副作用多，不宜长期使用，导致哮喘的控制率不尽人意，死亡率较高1 。中药成分虽然复杂，但其具有整体调节且毒副作用相对较小的优点，因此，从中药中挖掘抗炎平喘成分是未来哮喘研究的重要内容。本实验以引喘潜4伏期、EOS 和 Eotaxin 作为观察指标，探讨泡桐花总黄酮抗支气管哮喘变应性炎症的防治作用及其可能的机制。实验结果显示，泡桐花总黄酮可显著延长致敏豚鼠的引喘潜伏期，不同程度地抑制 BALF 中的 EOS 和白细胞总数及气道上皮Eotaxin 的过度表达，与模型组比较有显著差异。给药 5 d 和 12 d，泡桐
15、花总黄酮大小剂量不能预防再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘发作，并且动物死亡率高，这很可能是动物对抗原敏感度高所致。给药第 15 天，再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘发作较平稳，无死亡发生，可能与药效发挥和免疫耐受有关。 本实验结果表明，泡桐花总黄酮对哮喘具有一定的保护作用，其中泡桐花总黄酮可能通过调控Eotaxin 在气道黏膜上皮的过度表达，进而抑制 Eos 向哮喘气道的募集，消除气道炎症，成为其发挥抗过敏性哮喘的重要环节。参考文献：1 王国斌重视哮喘，正确诊治和控制哮喘J.中原医刊，2002，29（11）：40 2 Luis MTeran CCL Chemokines and asthmaJ.Immun
16、ology today，2000，21(5)：2353 刘 新，张 苏，崔 毅豚鼠气道炎症中 Eotaxin 基因表达的意义J.微生物学杂志，2005，25（3）：33.4 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编M.北京：人民卫生出版社，1975：466.5 张永辉，刘宗花，杜红丽，等中药泡桐花浸膏对哮喘豚鼠肺组织作用的病理学研究J.新乡医学院学报，2002，19(6):473.6 王 晓，程传格，刘建华.泡桐花精油化学成分分析J.林产化学与工业，2005，25（2）：99.7 宫兆华，董竞成，倪 健豚鼠支气管哮喘模型建立J.上海实验动物科学，2004，24(4)：204.8 Park SW, Kim do J, Chang HS, et al Association of interleukin-5 and eotaxin with acute exacerbation of asthmaJ
