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1、 研究用研究用 Code No. Code No. RR420ARR420A 说明书说明书 SYBRSYBR Premix Ex TaqPremix Ex TaqTM TM (Tli RNaseH Plus)(Tli RNaseH Plus) v201v201405405DaDa 目目 录录 内内 容容 页页 码码 制品说明制品说明 1 1 试剂盒原理试剂盒原理 1 1 制品内容制品内容 2 2 试剂盒外必备试剂盒外必备主要试剂和仪器主要试剂和仪器 2 2 保保 存存 2 2 使用使用注意注意 3 3 操作方法操作方法 3 3 实验实验条件的选择条件的选择 9 9 附附 录录 1010 质量标
2、准质量标准 1 12 2 关联产品关联产品 1 12 2 制品说明制品说明 本制品是采用 SYBR Green I*嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂。 制品中含有 Real Time PCR 反应的最适浓度 SYBR Green I，是一种 2浓度的 Premix Type 试剂，进行实验时，PCR 反应液的配制 十分方便简单。制品中使用了抗Taq抗体的的 Hot Start 法用 DNA 聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与 Real Time PCR 用最适 Buffer 组合，可以有效抑制非特异性的 PCR 扩增，大大提高 PCR 的扩增效率，可以 进行高灵敏
3、度的 Real Time PCR 扩增反应。 另外，本制品中添加了 Tli RNaseH(耐热性 RNaseH)，以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，可以最大限 度抑制由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 本制品适合于快速 Real Time PCR 扩增反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因 进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。 特长：1. 适用于 Real Time PCR 反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。 2. 在 2浓度的 Premix 中，预先混有 SYBR Green I，PCR 反应液配制时，只需加入模板
4、、 引物、灭菌蒸馏水便可进行 Real Time PCR 反应，操作简单方便。 3. DNA 聚合酶使用了TaKaRa Ex Taq HS，可以进行 Hot Start 法 PCR 反应，再与 Takara 公司独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。 4. 在 2浓度的 Premix 中，预先添加了耐热性 RNaseH(Tli RNaseH)，可以最大限度抑制以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时， 由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 *：Takara Bio 使用 SYBR Green I 作为研究试剂已得到 Molec
5、ular Probes Inc.的许可。 试剂盒原理试剂盒原理 本制品使用了TaKaRa Ex Taq HS 进行 PCR 扩增，通过检测反应液中 SYBR Green I 的荧光强度，达 到监控 PCR 产物扩增量的目的。 1 1 PCRPCR PCR 法是以微量 DNA 进行目的片段扩增的方法。通过 DNA 链的热变性、引物退火、DNA 聚合酶作 用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增 DNA 达 100 万倍以上。 本制品中的 DNA 聚合酶由于使用了TaKaRa Ex Taq HS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引 物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大
6、提高 PCR 扩增灵敏度。 2 嵌合荧光检测法嵌合荧光检测法 SYBR Green I 与双链 DNA 结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的 SYBR Green I 荧 光强度，达到检测 PCR 产物扩增量的目的。 具体原理见下图。通过 PCR 反应生成双链 DNA，SYBR Green I 与双链 DNA 结合发出荧光，通过 检测 PCR 反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的 DNA 片段的融解温度。 -1- 2.2.引物退火引物退火 3.3.延伸反应延伸反应 1. 1. 热变性热变性 制品内容制品内容（50 50 l l 反应反应20200
7、 0 次）次） SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus） （2Conc.）*1 1.0 ml5 ROX Reference Dye（50Conc.）*2 200 l1 ROX Reference Dye II（50Conc.）*2 200 l1 *1 内含TaKaRa Ex Taq HS， dNTP Mixture， Mg2+， Tli RNaseH， SYBR Green I 等。 （请参考“质 量标准”部分） *2 ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。 例如使用 Life Technologies 公司的 Real Ti
8、me PCR 扩增仪进行实验就需要校正。 需要使用 ROX Reference Dye 校正的仪器 Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Life Technologies) 需要使用 ROX Reference Dye II 校正的仪器 Applied Biosystems 7500 和 7500 Fast Real-Time PCR System(Life Technologies) 不需要校正的仪器 Thermal Cycler D
9、ice Real Time System Single (Code No.TP850/TP870) Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Code No.TP700/TP760) Smart Cycler II System*3 LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) *3 Smart Cycler is a registered trademark of Cepheid Corpor
10、ation. 试剂盒外必备试剂盒外必备主要试剂和仪器主要试剂和仪器 1.1. 试剂试剂 PCR 引物：引物设计请参考“附录 1.” 。 灭菌蒸馏水 2.2. 仪器仪器 特定的反应板或微量离心管 微量移液器和枪头（高压灭菌） Real time PCR 扩增仪（授权仪器） 适用的适用的 Real Time PCRReal Time PCR 扩增仪扩增仪 Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System、StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies） LightCycler
11、/LightCycler480 System（Roche Diagnostics） Smart Cycler II System（Cepheid） CFX96TM Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad） Thermal Cycler Dice Real Time System Single（Code No. TP850/TP870） Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Code No.TP700/TP760) 注：使用 Thermal Cycler Dice Real Time System II（Cod
12、e No. TP900/TP960）时，建议使用 SYBRPremix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(Code No. RR820A)。 保保 存：存： 4可保存 6 个月。 避光保存，避免污染。 干冰运输，到货后 4避光保存。 长期保存请置于-80，勿存于-20。产品融解后请于 4保存，并在 6 个月内用完。 -2- 使用使用注意注意 以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1 使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应效果不佳。 (1) 请勿涡旋振荡混匀。 (2) SYBR Premix Ex Taq (2 conc.)在-
13、80存放可能会产生白色或淡黄色的沉淀， 可用手握缓慢 溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。 (3) 沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。 2 配制反应液时，试剂请于冰上放置。 3 本制品中含有荧光染料 SYBR Green I，配制 PCR 反应液时应避免强光照射。 4 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。 操作方法操作方法 *请按照不同仪器的操作手册提供的方法操作。 应用应用 Applied Biosystems Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real7
14、300/7500/7500 Fast Real- -Time PCR SystemTime PCR System 和和 StepOnePlusStepOnePlusTM TM Real Real- -Time Time PCR SystemPCR System 的操作方法的操作方法 1. 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行） 。 试剂 使用量 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus） （2） 10.0 l 25.0 l 1 PCR Forward Primer（10 M） 0.4 l 1.0 l 0.2 M*1 PCR Reve
15、rse Primer（10 M） 0.4 l 1.0 l 0.2 M*1 ROX Reference Dye（50）or ROX Reference Dye II（50）*2 0.4 l 1.0 l 1 DNA 模板*3 2.0 4.0 l dH2O（灭菌蒸馏水） 6.8 l 18.0 l Total 20.0 l*4 50.0 l*4 *1 通常引物终浓度为 0.2 M 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.11.0 M 范围内调整引物浓度。 *2 ROX Reference Dye II（50）比 ROX Reference Dye（50）浓度低，使用 7500 Real-Time PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50） 。使用 ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System 和 StepOnePlusTM时，请使用 ROX Reference Dye（50） 。 *3 在 20 l 反应体系中，DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板 中含有的靶基因的拷贝数不同， 必要时可进行梯度稀释， 确定最佳的 DNA 模板添加量。 如果欲使用本制品进行 2 Step RT-PCR
