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1、色层技术（层析技术）,色层法是目前广泛应用的一种分离技术，本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在色层法已成为生物工程、生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。,色层分离方法 Chromatography,色层分离法是一组相关分离方法的总称，它的机理是多种多样的，但不管哪种方法都必须包括两个相。一相是固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移
2、动速度快，因而得到逐步分离。,层析法的发展过程,1903年 Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文，三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。 1931年 色谱法提出后，并未立即受到重视。经过大约20年，由于Lederer的工作，人们才重视色谱技术。 1938年 Izmailov和Shraiber第一次使用薄层色谱法。 1938年 Taylor和Uray用离子交换分离锂和钾的同位素。40年代，合成离子交换树脂商品出现后，离子交换色谱才得到广泛应用。1944年在美国橡树岭国家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元素。在1944年到50年代中，芝加哥大学和加州大学完成了超铀元素的分离。,19
3、41年 Martin和Synge发展了分配色谱。 1944年 Martin等发展了纸色谱。 1952年 Martin和James发展了气-液分配色谱。 1956年 Van Deemter等发表关于色谱效率的速率理论，并应用到气相色谱中。 1957年 制作离子交换色谱氨基酸分析仪。 1959年 在Cordon Conference上提出了第一篇凝胶过滤色谱的报告。 1963年 Giddings的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。,60年代中期 凝胶渗透色谱出现。 60年代后期 亲和色谱出现。 1969年 现代液相色谱开始受到重视。 有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领域的研究工作：1948年瑞典
4、科学家Tiselins由于他的关于电泳和吸附分析的研究获奖，1952年英国的Martin和Synge因为发展了分配色谱而获奖。,层析的原理,“层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。” 马丁（A. J. P. Martin）（英）,层析分离法,常用的层析技术有 (亲和层析、离子交换层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳） 特点： （1） 纯化倍数高 （2） 操作规模小，放大困难 （3） 最终产品纯化 （4） 适用于价格昂贵的产品,层析分离分类（1）,按溶质分子与固定相相互作用机理 吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力） 分配层析
5、（溶质在两液相间分配系数不同） 凝胶过滤（分子大小与形状） 实验技术分类 低压（小于0.5 Mpa) 中压 (0.5-5 Mpa) 高压 (5-40 Mpa) 电泳 (溶质在电场中移动）,分析色谱（10mg） 半制备色谱(10-50mg) 制备色谱(0.1-1g) 工业生产规模色谱(20g/d) 年产10g合格的重组人粒细胞集落刺激因子（rhGcs-F），其产值高达1亿元。,层析分离分类（3）,层析分离分类（3）,根据固定相形状分类 柱层析 纸层析 薄层层析 根据流动相分类 气相层析 液相层析 超临界流体层析 按操作方式分类（展开） 迎头法（frontal analysis) 顶替法 （dis
6、placement analysis) 洗脱分析（elution analysis),基本概念,（1）分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值 （2）解离常数 有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值 （3）分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数 (4) 阻滞因子分配层析溶质移动速度（距离）与流动 相移动速度（距离）比值 (5) 洗脱（容积）溶出体积 在柱色层分离中，使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积 (6) 分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比 (7) 理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡 时的一段柱高 （8）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之
7、比,色层分离法基本原理,色层分离法基本原理,分子筛层析示意图,t0,分配系数,在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律： Kd = C1/C2 K d为分配系数 C1，C2为两液相中的溶质浓度。 应用条件：温度一定 低浓度,解离常数和分离 因数,）,mt-结合溶质分子的有效位子 总浓度,m-空余的有效结合位子 浓度,q-溶质在固相的 浓度,c-溶质在液相的 浓度,解离常数,图 3 恒定缓冲液条件下，色层分离的拖尾现象,Rf =,阻滞因数,Am流动相的平均截面积 As-固定相的平均截面积,流动相的移动距离 V/Am,洗脱容积Ve,在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体
8、积,理论塔板fr第r块塔板上溶质的质量分数为：,r n E/(E+1)时,r max n E/(E+1),最大浓度塔板r max n E/(E+1),E=,N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移 高峰浓度减少、色带扩大,层析介质,要求： （1）不溶于流动相 （2）化学稳定 （3）机械强度 （4）大的表面积 （5）粒度均匀 层析介质种类 无机（氧化铝，硅胶，活性碳） 有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺等）,常用层析介质,氧化铝：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体 （1）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。 （2）分子式Al2O3简单，空间形态复杂，8种以上的形态 （3）同一形
9、态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径 分布、比表 面积等存在差异 （4）吸附量与含水量关系很大 制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。 吸附基团：铝离子 种类： 碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质 酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质 中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得 应用：有机溶剂中分离天然成分,硅 胶,硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质 （1）化学组成 SiO2.XH20， （2）属于无定形结构，基本结构质点为SiO四面体，相互堆 积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。 （3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。 硅胶的分类（常以孔径大
10、小来分）， (1) 特细孔硅胶 (0.8nm以下)。 (2) 细孔硅胶（1.52.0nm ) (3) 中孔硅胶 (4.0一5.0nm) (4) 粗孔硅胶 (10.nm以上) 应用：吸附层析剂与分配层析剂 优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离， 可用在水溶液中或有机溶剂中,琼脂糖,由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 中性不带电 水溶性线状多糖 高亲水性，含大量羟基 能制成多孔性凝胶，分离大分子 制备： 去除带电琼胶成分 将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。 采用交联剂增加介质的机械强度,琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构 a 琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构,
11、琼脂糖（2）,介质商品种类 Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B。 经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepharose CL-2B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B 应用 水溶液中分离蛋白质,葡聚糖,-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒 性质： （1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多） （2）化学稳定性及热稳定性好 （3）孔度与机械强度与交联度有关 （4）用于凝胶过滤分子筛 应用：水溶液中分离蛋白质等,纤维素,-1,4 相连的D-葡萄糖（偶而有1，6 键合）线性天然高聚物 （1）亲水 （2）微晶与无定型两
12、部分组成，缺乏孔度 大孔珠状纤维素 （1）高孔度 （2）高机械强度 （3 ) 亲水性强 应用：离子交换分离蛋白质介质,聚丙烯酰胺,性质： （1）丙烯酰胺与交联剂N, N-甲叉双丙烯酰 胺共聚 （2）烷烃骨架与酰胺侧链 （3）控制交联剂比例可控制网格孔度 （4）亲水好，但不如多糖介质 (5) 机械强度差 应用：（1）凝胶过滤 （2） 电泳介质,亲和层析,亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。 生物体内相互作用的分子对： (1) 酶底物或抑制剂 (2) 抗原抗体 (3) 激素受体 (4) 糖蛋白与凝集素 (5) 生物素
13、生物素结合蛋白等,基质活化方法与配基偶联,活化(activation): 基质（matrix）上的化学基团是不活泼的,无法与配基直接偶联,通过化学反应使介质上化学基团处于活化状态。 (1) 大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。 (2) 小分子配基, 在基质与配基之间插入若干碳原子手臂(spacer),然后再与配基偶联。 (3) 环氧氯丙烷, 1,4丁二醇缩水甘油醚本身是活化剂亦具有手臂作用。,活化方法（1）,A 溴化氰法 溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯到基质上、进而与配基偶联 优点: （1） 适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质 （2）用于含伯氨基小分子配基及伯
14、氨基大分子配基的偶联 （3）操作步骤简单,重现性好。 （4）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。 缺点： （1）形成的异脲键易产生非特异性吸附； （2）共价键不稳定,配基容易脱落； （3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放 。,溴化氰活化与配基偶联化学反应式,图 6,活化方法（2）,B 环氧氯丙烷活化 （1）所形成的共价键稳定,配基不易落脱 （2）自动引入手臂, （3）有更小的非特异性吸附, （4）活化操作简单易行,危险性相对较小 缺点：在强碱性条件反应，不适用于碱敏感物质。,环氧氯丙烷活化反应式,环氧基的氨化及偶联配基反应,活化方法（3）,C 对甲苯磺酰氯活化 （1）用
15、于活化含羟基基质、将羟基转化为磺酰 基、在配基偶联后容易脱落、不引入电荷。 （2）配基与羟基间形成稳定化学键。 （3）活化操作需在无水丙酮环境中进行，偶联 配基根据情况、既可在有机相中进行、亦可在 水相中进行。,对甲苯磺酰氯活化反应式,手臂（spacer),作用 ：减少亲和作用空间位阻 连接：通过化学反应与活化基团连接 手臂化合物： 乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2-CH2- NH2 6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2- COOH 环氧氯丙烷 1、4 丁二醇缩水甘油醚,D 残余电荷的掩蔽,目的：防止产生非
16、特异性吸附 原理：通过化学反应消除基团上的电荷 方法： （1）自发水解 （2）氨基：醋酸酐 （3）羧基：水溶性碳二亚胺,手臂氨末端的掩蔽,残留羧基掩蔽反应,E 活化基团与配基密度测定,方法： （1）氨基或羧基可用酸碱滴定。 （2）有紫外吸收特征的、可用紫外分光法测定。 （3）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶 联率较高的情况） （4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定,F 亲和介质吸附容量测定,方法： （1）流出曲线法： 流出液中目标蛋白浓度达到进 口浓度的90% （2） Langmiur 吸附等温线法,层析装置与操作,装置 1 普通 2 高级 柱操作 （1）装柱：均匀，无气泡 （2）平衡（equilibrium)：缓冲液,pH, 盐浓度 （3）上样(loading)：蛋白浓度，pH, 盐浓度，缓冲液 （4）洗涤(washing)：pH, 盐浓度，洗涤剂，缓冲液 （5）洗
