整理wb步骤

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1、Western blot 流程梳理流程梳理 第第 1 步：步：细胞蛋白提取细胞蛋白提取 1.1 物品：细胞，1ml/200ul/100ul 移液枪/枪头，1.5ml EP 管。 1.2 试剂：PBS：购买 1L 装 PBS 粉剂配制，过滤后使用； RIPA 裂解液：1ml 原 RIPA 裂解液+ 10 ul PMSF 配制。 1.3 细胞步骤：从细胞间取 6 孔板PBS 洗涤：1ml 枪移去培养液，加 PBS 轻柔洗涤 3 遍加 RIPA 裂 解液：150ul 每孔，加液时分散点加，有助于裂解液充分接触细胞反应 5min刮脱：用细胞刮反复刮脱 细胞，微微倾斜孔板，将液体刮于一侧便于吸出，将各孔

2、内液体分别吸到相应的 1.5ml EP 管中，注意应事先编号便 于区分超声震碎：按照说明震碎细胞，使细胞内蛋白充分析出离心：超速离心机 12000G 离心 15min转移：从离心机中取出样本，取出上清液与相应 1.5ml EP 管中，剩余沉淀舍弃，注意事先标记 各取 20ul 样本与另一相应 EP 管用于测蛋白浓度，剩余放于80保存。 1.4 组织提蛋白步骤：剪取组织适量(3mm*3mm*3mm 左右大小)，用 PBS 洗去血液，滤纸吸干水分，放于 1.5ml EP 管中，加 RIPA 裂解液 500ul，小剪刀伸入 EP 管中剪碎组织，使用电动匀浆机伸入 EP 管液面下充分搅碎组织， 然后离

3、心、转移上清液的操作如前。 1.5 取出用于测蛋白浓度 20ul 样本处理：于各 EP 管中分别加入 180ul 三蒸水得 20 倍稀释液，放入 4保存或 现用。 第第 2 步：步：测蛋白浓度测蛋白浓度Lorry 法法 2.1.配置配置 lorry A/B 液液 配方：A 液(250ml)： 试剂 百分比 1000 ml 250 ml Na2CO3 2% 20g 5g NaOH 0.4% 4g 1g 酒石酸钠 0.6% 1.6g 0.4g SDS 10% 10g 2.5g H2O 加至 1000 ml 250 ml B 液：4%CuSO4 (200 ml) 试剂 百分比 1000ml 200m

4、l CuSO4.5H2O 4% 40 g 8 g H2O 加至 1000ml 200ml lorry A/B 液配好后放于常温，三者可长时间储存。 2.2 标准蛋白液的制备标准蛋白液的制备 取 15ml 离心管，三蒸水清洗 3 次，保证干净精确称取牛血清白蛋白（ABV）20.0mg ,加入三蒸水 10ml, 充分混匀，得 2mg/ml 蛋白溶液分装：1ml/支分装于 1.5 ml EP 管中；取 250ul 2mg/ml 蛋白溶液于 1.5ml EP 管中，加三蒸水 750ul，得 0.5mg/ml 蛋白标准品。 按下表配置 0、25、50、100、200、300、400、500 ug/ml

5、蛋白梯度标准品各 500ul，做好相应标记，4冰箱 保存。 浓度(ug/ml) V(0.5mg/ml 蛋白标准品)(ul) V(三蒸水体积)(ul) V 总(ul) 0 0 500 500 25 25 475 500 50 50 450 500 100 100 400 500 200 200 300 500 300 300 200 500 400 400 100 500 500 500 0 500 上述蛋白标准品配好后放于 4。 事实上，实验室同学都是用购买的 0.5mg/ml 在 96 孔板上现配不同浓度标准蛋白制作标准曲线。一次性配制较 多不同浓度标准蛋白优缺点如下： 优点：1.加样时加样

6、体积较现配大，减少加样误差；2.一次性配制储存，上样时直接有现成不同浓度梯度标准 品，缩短上样时间。 缺点：1.蛋白水溶液放置时间过长易降解；2.配制标准品为从试剂商购买牛血清白蛋白，较购买现成的蛋白标 准品精确性差。 2.3.Lorry 法测蛋白含量法测蛋白含量 使用 96 孔板上样，因每孔最多能装约 300ul，故上样体积减半如下。 2.31 取 15ml 干净离心管，蒸馏水涮洗 3 遍，00 甩干水，依次加入 10ml A 液、100ul B 液，摇匀得 Lorry C 液， 室温反应 10 min。 2.3.2 C 液反应期间，各孔依次加入梯度蛋白标准溶液、样本（一般各加 2 组，每组

7、 8 孔，同一浓度吸光度取平 均值）150ul各孔依次加入 C 液 50 ul各孔依次加入 Folin 酚 15ul暗室避光反应 45min分 光光度计 630 nm 处测吸光度。 2.4 标准曲线的绘制标准曲线的绘制 实验室酶标仪设置 630nm 下测定各孔内分光度复制数据至 excel 表格除去未加样品无效数据 将各梯度浓度标准品及样品重复加样所得的两个吸光度值分别取平均值。 以各梯度浓度标准品吸光度作为 x 变量，浓度作为 y 变量作标准曲线，可舍弃部分明显偏离值，在设置中显示 标准公式，标准曲线2 需大于 0.99 才可以使用。 将各样本吸光度均值带入回归公式求得所测样本总浓度，但因所

8、测样本实为原样本稀释 20 倍所得，故提取样 本蛋白总浓度需乘以 20。 以最小浓度组体积为标准配平， 分别计算要是各提取样本总蛋白浓度相等需要多少体积原 液,再用 PBS 配平。 从80冰箱取出原蛋白样本，按照计算体积配平至所需浓度，加入 1/4 体积的 5 乘 loading buffer，震荡摇匀， 沸水煮 10min 至蛋白完全变性减少降解损耗，再次放入-80冰箱备用。 第第 3 步：步：配胶配胶 3.1 试剂试剂：dd H2O，29%(w/v)丙烯酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液，pH 6.8 1M Tris-HCl，pH 8.8 1.5M Tris-HCl，10%

9、 SDS，10% AP，TEMED 配方： 项目项目 1 M Tris-HCl PH6.8(配浓缩胶用配浓缩胶用) 1.5 M Tris-HCl PH8.8(配分离胶用配分离胶用) Tris 碱 12.1g 18.17g H2O 80 ml 80 ml 12N-HCl(36%-38%) PH 仪调节 PH 至 6.8，H2O 定容至 100ml PH 仪调节 PH 至 8.8，定容至 100ml 储存 用 100ml 蓝口瓶配制，4保存 项目项目 10% (w/v) SDS 10% (w/v) AP - 1.0g SDS 1.0g AP(过硫酸铵) H2O 8 ml 溶解后定容至 10ml 8

10、 ml 溶解后定容至 10ml 备注 15ml 离心管配制,2ml EP 管分装后室温保存 15ml 离心管配制,2ml EP 管分装-20保存 TEMED 直接购买 3.2 物品准备物品准备：50ml 离心管 2 个(分别专门用于配分离胶、浓缩胶，标签标明用途防止混淆)，离心管架，烧杯， 各量程枪、枪头，配胶玻板，配胶架，配胶梳子，橡胶垫。 3.3 步骤：步骤： 3.3.1.准备罐胶槽： 将玻璃板擦干净烘干后， 放入配胶架， 两玻璃板及架子的底缘须在同一平面对齐 （否则漏胶） ； 装上橡胶垫，将短架子装在长架子上，短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶。 3.3.2.准备：将各溶液（ddH2O

11、，29%(w/v)丙烯酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液，Tris-HCl，SDS， APS，TEMED）依次摆好，调好取 TEMED、APS 的枪。 3.3.3.配分离胶：在烧杯上装半杯 ddH2O；在专门装分离胶的 50ml 离心管中按下表所需浓度分离胶比例，依次 加相应体积 ddH2O，29%(w/v)丙烯酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液，Tris-HCl，SDS。最后加 APS、 TEMED，加样时要迅速，快速摇匀。用 1ml 枪将胶从玻璃板中间注入，注胶速度均匀，不要产生气泡，离心管中 留少许以观察胶凝固情况。罐胶后用异丙醇压胶，注入异丙醇时要均匀轻

12、柔。分离胶凝固约 30min。 3.3.4.配浓缩胶：分离胶离心管中交凝固时可倒掉玻板见压胶异丙醇，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。 按表格依次在浓缩胶专用 50ml 离心管中加入相应溶液，摇匀，迅速灌入玻板间，不要产生气泡，离心管中留少许 以观察胶凝固情况。浓缩胶凝固快，灌胶后即刻轻柔插入配胶梳子，不要产生气泡。5-20min 浓缩胶即可凝固。 3.3.5.配胶凝固后轻柔取下玻板，胶现用加样，也可保鲜膜包裹后放入 4冰箱存放充分凝固。4过夜凝固的 胶条带更细更均匀。清洗干净配胶架后放回原处。 第第 4 步：电泳步：电泳 4.1 试剂试剂 10 乘电泳液(running buffer)、1

13、0 乘电转液(transfer buffer)、20 乘 TBS 配方如下： 试剂 10 乘电泳液(running buffer) 1L 10 乘电转液(transfer buffer) 1L 20 乘 TBS 1L Tris Base Tris Base 30.275 g Tris Base 30.275 g Tris Base 48.4 g Glycine(甘氨酸) Glycine(甘氨酸) 144 g Glycine(甘氨酸) 144 g 其他 SDS 10 g NaCl 160 g 备注 加 800ml H2O 溶解完全，定容 至 1L，室温保存。使用时加 H2O 稀释 10 倍使用，

14、2 块胶约 需 600ml。 加 800ml H2O 溶解完全，定容 至 1L，室温保存。使用时以配 1L 电转液为例，取 100ml 10 乘电转液稀释至 800ml,再加 200ml 甲醇及配得。 加 800ml H2O 溶解完全，用浓 HCl 在PH 仪检测下调节PH 至 7.6，定容至 1L，室温保存。使 用时稀释 20 倍，每 500ml 加 1-2ml 吐温-20 得到 TBST 工作 液。 4.2 物品准备物品准备 电泳槽，电泳架，20ul 枪、上样专用长尖枪头或专制微量上样注射器，电泳超盖子，电源。 4.3 步骤简述步骤简述 4.3.1 取出包有已凝固凝胶的玻板，将玻板放入电泳

15、架，短玻板朝里，长玻板朝外。电泳架设计夹两块胶，单块 胶要加用塑料玻板。夹好的电泳架中间盛电泳液不会露水。 4.3.2 上样：把电泳架放入电泳槽，注意电极及电极方向。先从电泳架两玻板间倒入新鲜电泳液，至电泳液漫出 槽内到所需量。轻柔拔出梳子，注意力道适中，不能太快，防止气泡产生。使用小枪头上样(有专门的上样长枪头)， 按样本浓度计算上样体积，上样蛋白总量应至少 60ug，上样体积一般 20-40ul。枪头先伸入至快接近胶面时开始降 将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，枪头随液面上涨而上提。可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品 都须同样处理。 4.3.3 电泳：连接电源，80V 至 mar

16、ker 分离后，130V 电泳至蓝色蛋白样本将近玻板下缘处停止电泳。电泳时间 一般 40-60min。 第第 5 步：转膜步：转膜 5.1 物品准备：1 乘电转液(取 10 乘电转液 100ml + 200ml 甲醇+H2O 至 1L 4预冷备用)，甲醇，PVDF 膜、转 膜夹、海绵网、转膜滤纸、小盘子、冰袋等。将小盘子装适量电转液，一边放转膜夹、海绵垫、滤纸，电转液打湿 备用，转膜夹黑色面朝下，白色面朝上。 5.2 揭胶：电泳结束后，将电泳槽移至水池中，电泳液可使用 1-2 次，取出电泳架，取出两边玻璃板，纯水冲干 净，切胶塑料板从边角小心揭开短板，切去掉集成胶。对照 marker 小心将目标蛋白所在范围区域胶切下放入倒有电 转液的盘子中。 5.3 剪膜、激活：测量切下凝胶长宽值，剪下相应大小 PVDF 膜，标记右上角。在小盒子里倒入适量甲醇，用 专用塑料小镊子取膜到甲醇中侵泡数秒激活。 5.4 转膜：依次在转膜夹黑