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1、农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤 整理人:早熟组 赵凤利1、 准备试剂:1. 加有三抗的YEB或LB液体培养基,用于摇菌;2. 渗透液(50ml):250mg D-glucose,5ml MES 原液,5ml Na3PO412H2O 原液,5ul 1M 乙酰丁香酮原液,加dH2O至50ml。1) . 500 mM MES (Sigma):4.88 g溶于50ml dH2O,保存于42) . 20 mM Na3PO412H2O (BDH):0.38 g 溶于50ml dH2O,保存于43) . 1M 乙酰丁香酮:0.196 g,加DMSO至1 ml,可分装成小剂量,存于 -20。2、 实验步骤
2、:1. 将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇,28,200rpm;2. 取1-1.5 ml 菌液,加到灭菌的1.5ml离心管中;3. 1000 g,10 min,沉淀菌体(室温),去上清,加1 ml 渗透液,悬浮菌体;4. 重复步骤3,进一步除去少量的抗生素;5. 取少量悬浮菌液稀释10倍,测定OD600值,并乘以10,作为悬浮菌液的OD600值; 注:如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间,说明有大量的死菌细胞,将降低转化的效率。6. 确定悬浮菌液对渗透液的滴定度,计算稀释系数,使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml,OD600为0.01-0.1,通常0.5-1.0 ml的最终悬
3、浮菌液就能满足侵染了;如:需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液,而测定的悬浮菌液的OD600=0.4,则最终悬浮菌液中,悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul,则需要渗透液为375 ul。7. 在1.5ml离心管中,配好最终悬浮菌液,准备侵染;8. 侵染前,将烟草放于白色荧光灯下1 h,使其气孔打开;9. 选择倒三叶和倒四叶,用于侵染(于两叶脉之间侵染),一株选两叶,侵染一种菌液;10. 用去掉针头的注射器,轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2),或用小针头刺穿,以去除其蜡质层;11. 侵染前,用记号笔标记待转区域;12. 将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中13. 将注射器对着叶片背面的待转区域,一手按着叶片上面,另一手轻轻推动活塞,直到看到液体扩散,再侵染其他部位,侵染后,用记号笔圈定侵染区域;14. 将侵染后的烟草放回培养室15. 2-3天后: 1). 亚细胞定位实验:切掉侵染区域,制片,荧光显微镜观察; 2). 启动子GUS活性:GUS染色,75%酒精脱色,观察结果。参考文献:Nature Protocols, 2006: 2019-2025.